ダブルダイジェストできない制限酵素反応

質問

ダブルダイジェストできない制限酵素反応について教えてください。一回目の反応→フェノクロ、エタ沈→二回目の反応というやり方でやる場合、フェノクロを省くことは可能でしょうか？エタ沈だけでは酵素をとりのぞけないんでしょうか？仮にそうだとしても、一回目の酵素を熱で失活させるor一回目の酵素が二回目のバッファでは活性を持たない場合ならOKとかそういうことはないでしょうか？

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

>。一回目の反応→フェノクロ、エタ沈→二回目の反応というやり方でやる場合、フェノクロを省くことは可能でしょうか？

バッファー交換するとき注意すべきは、前の酵素が失活していないと、至適ではないバッファー中でスター活性がでる場合があることです。
たいていの酵素はエタ沈で失活するので、フェノール抽出はいりません。
エタ沈で失活するか、フェノール抽出が必要か、熱失活できるかなどは、たいていのメーカーカタログに書いています。

また、L, M, Hのように主に塩濃度の違うバッファーで二重消化する場合は、塩濃度の低いほうの消化をしてから、高いほうの塩濃度に調整して次の消化をすればいいです。至適塩濃度の低い酵素が高い塩濃度に入った場合は、切れなくなるだけでスター活性の原因にはならないので、途中で失活させる必要はありません。諸般の事情で塩濃度高→低の順番に消化しなければならない場合は、最初の消化のあと、熱失活ができるなら、塩濃度を薄めて次の酵素で消化をすることができます。

お礼

タカラのカタログにありました。結構失活したりしなかったりいろいろのようですね。

回答No.2

otx

こういうことはメーカーのカタログに、たとえばTAKARAのカタログなんかは、相当詳しく書いてあります。

学生でも、まずはそこをチェックします。
ご自分で調べられてはいかがでしょうか？

補足

タカラのカタログにありました。見落としていたようです。失礼しました。