細菌ゲノムをプラスミドに組み込む

質問

細菌ゲノム（Sphingomonasというグラム陰性菌）のゲノムを制限酵素で消化し、その断片をpUC18等のプラスミドにライゲーションし、大腸菌に導入しようと考えていますが、そこで教えていただきたい点があります。このような目的で細菌ゲノムを調整する場合、ＣＴＡＢによる多糖除去等する必要があるでしょうか。それとも、フェノクロ＆エタ沈（イソ沈）＆RNase処理で十分ですか？

回答No.1

yutaka007 · ベストアンサー

ありきたりの回答ですが、、、。

もし私なら、きれいに精製します。というのは、１）制限酵素で切る時に夾雑物があると、効率が悪くなる（非特異的切断の可能性もある）から、２）ベクターにライゲーションする時に夾雑物があると効率が低くなる可能性があるから、３）ライゲーションの際にべクターとインサートの量比をコントロールしなければならないので、夾雑物があると、正確にインサートの量を測れないから　等です。

誰でも思うことですが、きれいなDNAが大量にある方が実験をコントロールしやすいですよね。　

で、実験ですが、やってみれば案外、汚いDNAでも出来たりしますよね。只、ゲノムを全部カバーするライブラリーを作りたいのであれば、ちょっと大変でもがんばってきれいなDNAを使ってやった方が、将来的にも使えていいですよ（経験者談）。ちなみに、私は超遠心までかけました（そんな必要ないのかなー、、、）。

お礼

レスを有難うございます。
超遠心までかけられたのですか。。。
そう考えると、ＣＴＡＢくらいで面倒くさがっていたらいかん、ということですね。。。