制限酵素地図の作製について

質問

初質問です。よろしくお願いします。

プラスミドＤＮＡを５種類の制限酵素で切断し、電気泳動させて、制限酵素地図を作ろうと思ったのですが、
計算してもＤＮＡサイズの合計が全然違います。
（例えば、Hind3で切ったときは、7.6、5.8、0.5(×10^3)、Hind3+BamHIで切ったときは、5.8、3.6、1.1、0.46(×10^3)という具合です。）
この場合はどのように処理すればよいのか教えてください。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

たとえば、HindIII 7.6が、内部に複数のBamHIサイトを持っていて、3.6+1.1+1.1+1.1+0.46+0.46に切れるとか（誤差を考えると妥当なところでしょう）。
複数のバンドがほぼ同じサイズで重なっているのではないでしょうか。

DNAを消化すると、各断片の分子数は同じですから、長さと重量が比例し、染色強度は短い断片ほど薄くなります。しかし、複数のバンドが重なっていると、このグラディエントから予想されるより濃く染まるので見分けが付きます。

注意点をいくつか

ゲルにEtBrを入れて泳動すると、EtBr自体がDNAとは逆方向に流れるので、断片の短いほうから染色が悪くなります。一枚のゲルの中で染色度合いが異なっていると、上記のようなことを見落とす可能性があるので、後染めにしたほうがいいです。

ゲル濃度ごとの分解能の範囲はそれほど広くないので、断片の長さの範囲が広い場合は注意が必要です。たとえば、1 kb～10 kb位に適した濃度のゲルでやったとしたら、0.5 kb以下の断片は分離し切れていなかったり、バンドがぼやけて正確な情報が得られません。

質問にあげられた例では、BamHIのみの消化の結果と併せて考えれば、見当が付くのではないでしょうか。

お礼

なるほど確かに太くなっていたり、濃くなっているバンドもあります。
回答を参考にもう一度検討してみます。ありがとうございました。