TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。

質問

TAクローニング後のシークエンスに関して教えてください。
生命工学の分野で実験している大学生です。

現在、遺伝子のクローニングを行っています。
ある生物由来のRNAからcDNAを合成し、cDNAをテンプレートとして約1000bpの目的遺伝子をPCRにて増幅、増幅断片をTAクローニングでTAベクターに入れました。
インサートの確認をするため、ベクタープライマーでシークエンスをしましたが、その配列の解読に困っています・・

フォワードのプライマーで読んだ配列は、目的遺伝子配列の相補鎖となっていました。これで、3'側が900bpほど確認できました。しかし、リバースのプライマーで読んだ配列がどうなっているのかよくわかりません・・。

TAクローニングではインサートが逆向きになることがあるとのことですが、これはそのケースでしょうか？その場合、リバースプライマーで読んだ配列はどのような配列になるのでしょうか？

初投稿で読みにくい、説明不足な点もあるかと思いますが回答よろしくお願いします。

回答No.3

emujei

900以上はR primerで確認していないということでしょうか。それとも読めないということでしょうか。
既に他の方がおっしゃられたように、逆に挿入されてしまうことはあり、私も経験しております。私の場合、挿入配列の内部のある制限酵素認識サイトがあり、またその酵素も所持していたためインサートの外部と内部でダブルダイジェッションを行い、その後シークエンシングを行っております。また、私が経験した一つに、挿入配列の末端が一部切れて挿入されてしまったことがあります。これはPCRの仮定で伸びきっていなかったか、配列が切れてしまったのか(切断酵素などは入っていないのでこの可能性は薄いですが)はわかりませんが。
プラスミドをダイレクトに読むよりは、ベクター上の配列からPCRで増やしてからその産物を読むほうがきれいに読めますよ。私もまだまだわからないことだらけですが、お互い頑張りましょう。

回答No.2

sakasagitsunen

xxsilkwormxx さん　こんにちは

日数も経ち、既に解決したかもしれませんが、もしものために回答を致します。

おっしゃる通り、ベクターに目的の遺伝子断片が入り込む際、逆向きになることがあります。

逆向きの場合、プラスミドのプライマーでシークエンスを行うと、塩基配列は、完全に反転（（a）配列順序が逆転しており、（b）t→a, a→ t, c→g, g→c　塩基が反転している）しております。

ご存知のように、反転していようとも、どのような種類の塩基配列が得られたかどうかを確かめるには、

DDBJのBLAST検索にかけると判明します。　http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html

しかし、お困りのように（このポイントであると推定・・）、ClasalXなどのソフトで得られた遺伝子断片のどの塩基が特異的であるかを調べたり、その後、NJplotなどのソフトで系統樹を作成したりする場合、塩基配列の反転を元に戻す必要があります（これらのソフトは自動的にやってくれませんので・・）。

その場合、塩基配列の反転を元に戻すためのソフトSeqConv　http://www.vector.co.jp/soft/win95/edu/se378751.html

がおすすめです。

ただし、気になる点がありまして、相補鎖という難しい言葉をご存知なので、いずれのソフトもご存知で、全く誤った回答をしているという気もしております。

ご質問の文面からもう一つ考えられるのは、解読に困ったサンプルは、もしかすると、目的の遺伝子が入っておらず、ベクターの塩基配列が900bp？ほど読まれたのかもしれません。その場合は、DDBJのBLAST検索で、その遺伝子断片が何者か判明しますので、確認してみて下さい。

回答No.1

negigi

ちょっと質問の意味が分かりにくいのですが、

forwardプライマーで配列を読んだプラスミドとreverseプラマーで配列を読んだプラスミドは同じものなのでしょうか？つまり、同じ大腸菌コロニーから増やしてmini prepし回収したプラスミドか、それとも別々のコロニーから回収したものかということです。TAクローニングでは末端の形がどちらも同じため、順方向と逆方向の2通りに入ります。ですが、1つのコロニーには1方向のプラスミドしか存在しません。

また、よく分からない、の意味も曖昧です。目的の配列と完全に異なっていたのでしょうか？

とりあえず、
forwardで読んだ配列が目的の配列の相補鎖であるのなら、reverseで読んだ配列は目的の配列そのものになります。実際にTAクローニングの様子を絵で書いてみては？