シーケンスが上手くいきません。TAクローニングを行う利点とは!?

質問

はじめまして。現在自分は理系の大学に通う4年生です。
生物学に重きを置く研究室で、未知遺伝子の解析を行っています。

先月その未知領域を思われるＤＮＡの増幅に成功しました。早速シーケンスを施したところ、ＧやＮだらけでピークも低く、上手く読めていませんでした。ここで自分なりに考察した事は以下の通りです。

1.不純物除去のためエタノールによる沈殿を施した際、エタノールと一緒にＤＮＡも捨ててしまった(要するに実験が下手クソ)。

2.上と同じ操作の際、エタノールの乾燥除去の際、幾つかのＤＮＡが熱変性した。

3.ＰＣＲの際、アニーリング温度が不適当。

素人考えで恐縮ですが、こんな事です。
以上の話を教授と相談したところ、『ダイレクトシーケンスを行うよりは、ＴＡクローニングをした後にシーケンス解析をしてみよう』と言うことになりました。

幾つか説明を聞いたところ、勉強不足な自分は半分くらいしか理解していません。ベクターに対応するプライマーを用いることでＰＣＲ産物全域を読める事くらいしか…。

もし詳しく解る方、同じような経験をお持ちの方がいらっしゃれば、ご意見をお聞かせ下さい。

回答No.2

teru-arai · ベストアンサー

シークエンスのキットにはポジコン用のプラスミドとプライマーがくっついていると思います。初心者がやるときはポジコンも同時にやると良いです。
質問がいくつもあります。DNAはバンドはゲルから切り出して精製したものを用いたのかな？　
それから、AGCTのシグナル強度はどうだったんですか？　ここで訊くなら、それくらいの情報は書きましょう。強度次第で配列が読めないことの原因が変わるの分かりますよね？　

＞(要するに実験が下手クソ)。
こういう時のためにポジコンが付いています。考えうる失敗の原因を狭めてくれます。
１はどこの段階か不明。シークエンス反応前か後か？　両方か？
２はちょっと意味不明。変性って、一本鎖になるという意味？　PCRするときもシークエンサーにかけるときもDNAは変性するけど？
３は、バンドが出ている以上、普通は問題ないはずだけど？　条件を変えたのですか？
ただし、きれいなシングルバンドならいつでも問題ないとは限らないです。昔ある遺伝子のcDNAをクローニングした時のとんでもない経験をヤフーの知恵袋の答えに書いてます。興味があれば見てください。
http://detail.chiebukuro.yahoo.co.jp/qa/question_detail/q1216646832
こういうことがあると、ダイレクトシークエンスでは絶対に読めないでしょう。

PCR産物をクローニングせずにダイレクトにシークエンスすることは可能ですが、きれいに読めないことが多いです。私がやるときはうまくいけばめっけもんと言うつもりでやります。あまりダイレクトをやらないのは、どのみちクローニングするものなら、クローニングしてから読んだ方がきれいに読めるので、ダイレクトで苦労する意味がないからです。。

お礼

回答有難うございます。
大変参考になり、感謝です。

＞＞AGCTのシグナル強度はどうだったんですか？
説明不足、深くお詫び申し上げます。
現在使用している解析機のプロトコルによれば、データに関してはシグナル強度をピークポイント数として表しています。シグナル強度が高いものは値が最大1300程で表示されます。自分のシーケンスデータだと、300～500未満の値しか確認できませんでした。若干確認できるGの幾つかには、中途半端に1000前後のピークポイント数は確認できます(解析不能データなのであてにはなりませんが)。

＞＞１はどこの段階か不明。シークエンス反応前か後か？　両方か？
こちらも説明不足で申し訳ないです、後です。

＞＞２はちょっと意味不明。変性って、一本鎖になるという意味？PCRするときもシークエンサーにかけるときもDNAは変性するけど？
はい、その通りでした。
また、1本鎖でもシーケンスできるため、杞憂でしたね…

＞＞３は、バンドが出ている以上、普通は問題ないはずだけど？　条件を変えたのですか？
現在はプロトコルに添って50℃で行っています。
Tm値を計算し、その温度でシーケンスPCRを行えば改善が見られる…などと都合よく考えています(-。－；)

＞＞昔ある遺伝子のcDNAをクローニングした時のとんでもない経験をヤフーの知恵袋の答えに書いてます。
こちらも大変参考になりました。現在、コントロールを用いて2回目の解析に臨んでいます(DNA回収の下手クソ云々を知るため)。それでダメなら、こちらの体験を参考に、プライマーの再設計に取り掛かろうと思います。

つっこみ所が多いかと思いますが、今無い知恵を絞って考えていることはこんな事です。

回答No.3

teru-arai

＃２です。間違えて別なところに、ちょっと前に同じようなことを書いたのですが、困ったことに下の文をそっちへ貼ってしまいました！（そっちの方ご迷惑かけます）

＞現在使用している解析機のプロトコルによれば、データに関してはシグナル
＞強度をピークポイント数として表しています。シグナル強度が高いものは値
＞が最大1300程で表示されます。自分のシーケンスデータだと、300～500未
＞満の値しか確認できませんでした。若干確認できるGの幾つかには、中途半
＞端に1000前後のピークポイント数は確認できます(解析不能データなのであ
＞てにはなりませんが)。

　ちょっと前に書いたばかりですが、シークエンスが読めないケースは主として３つあります。
１．シグナルが弱すぎる。
要するにものがないからと思われます。原因はエタ沈失敗、酵素失活、何かを入れ忘れ等々、多数。
２．シグナルが強すぎる。
シークエンサーには解析できるシグナル強度の上限があります。それを超えるとうまく解析出きません。このときはサンプルを希釈すればすぐはかれます。
３．シグナル強度は適正範囲。
この場合、シークエンス反応、エタ沈等問題ないはずで、普通は読めるはずです。読めないのは、波形がいくつか重なっているためと思われます。つまり、元のDNA にコンタミが多いあるいはシークエンスPCR反応時のプライマーの特異性が低い等が考えられます。

我々は、アップライドバイオシステムの310を用いています。シグナル強度は装置のコンピューターで波形データをプリントすると右上に書いてあります。３１０ですと、読めるシグナルの範囲は下限が100くらい、上限が1500～2000くらいです。
質問者さんの装置の上限下限が解りませんが、３１０と同じだとすると、300～500は（３１０なら）ばりばりに読めるはずの値です。ものは充分にあるわけで、エタ沈等での失敗ではないと思います。
考えられる対策は、１）サンプルDNAにコンタミが多いので、TAクローニングしてからシークエンスする、あるいは、２）おっしゃっているとおり、シークエンスPCRのアニーリング温度を上げてみる等があります。
私にはサンプルDNAにコンタミが一番怪しく思えます。質問者さんの教授殿がおっしゃられるとおりTAクローニングすれば読めるのじゃないですか。

回答No.1

tunertune

１,２はDNAを泳動してみれば分かると思いますが。
３はDNAの増幅に成功しているんだから関係ないのでは？

もしかしたら、プライマーが原因じゃないですかね。
どんなプライマーを使って増幅しましたか？

クローニングの利点は、クローンだということと必ずプライマーがあたるということではないでしょうか。

お礼

早速回答を頂き、感謝です。

＞＞もしかしたら、プライマーが原因じゃないですかね。
どんなプライマーを使って増幅しましたか？
現在その未知領域の増幅を目的とする種の遺伝子のうち、明らかにされている領域(既知領域)の中から、下流側に向かうプライマーを用いています。29merです。

そのプライマーより特異的な増幅が行われることで、今回初めて確認できたＰＣＲ産物中に含まれる配列に、その種の未知領域遺伝子があることが明らかになる…といったカンジです。

＞＞クローニングの利点は、クローンだということと必ずプライマーがあたるということではないでしょうか。
成る程、有難うございます。…てことは、ＰＣＲの前に、つまりプラスミド精製前に、組み込んだ後培地への塗布を行わなければいけませんね…苦手です(笑