ベストアンサー ウエスタンブロッティングについて 2009/12/12 10:18 ウエスタンブロッティングを初心者に上手く分かり易く簡単に言葉で説明するにはなんと言ったらよいのでしょうか？ みんなの回答 （1） 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー de_tteiu ベストアンサー率37% (71/189) 2009/12/12 22:48 回答No.1 多くのタンパク質の中から特定のタンパク質を選択的に検出する方法 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学生物学 関連するQ&A Western Blotting 近々Western Blottingをやります。 その際、目的蛋白質と一緒にα-チューブリンなどの内部標準蛋白（？）もBlottingできますか？ また、２次抗体が、例えばマウスとラビットで異なっていても同時にBlottingできますか？ 抗体染色のときは異なる２次抗体を使って染色するので、Western Blottingでも大丈夫な気がするのですが、回りにやったことがある人がいないので分かりません。 論文に載っているような内部標準はどうやって出しているのでしょうか？ 別々に作っているのでしょうか？ ウエスタンブロッティングについて ウエスタンブロッティングでは、どうして一次抗体と二次抗体の2種類の抗体を使うのかがよく分かりません。 宜しければ教えてください。 immunoslot blottingとwestern blottingの違い 生化学系の論文を呼んでいるのですが、 immunoslot blotting という方法を用いています。 どうもwestern blotting とほぼ同様の手法で、 サンプルを希釈段階ごとに分けられる方法だと思うのですが、いまいちよくわかりません。 immunoslot blotting についてご存知の片、 その原理とwestern blottingとの違いを教えていただけないでしょうか。 また、マテメソのimmunoslot blottingの項に、サンプルをslot chambersにアプライするという表記があります。 ゲルのスロットと同義なのでしょうか。 こちらもあわせてお願いします。 ウエスタンブロッティング法のブロッティングについて ウエスタンブロッティング法のゲルからブロッティン紙にブロッティングする際に、3回に1回ぐらいブロッティン紙の一部がちょっと透けたようにみえることがあり、このときは決まってうまくいきません。（バンドが出ず、でても相当薄いです）時間が長すぎるのでしょうか？どこが悪いのか教えてください。 ブロッティングの時間は1時間45分で200V,200mAで行っています。紙は、milliporeのimmunobilonを使用しており、wet法でやっています。 ウエスタンブロッティングついて・・・ ウエスタンブロッティングの操作においてブロッキング溶液にスキムミルク溶液を使用するのは何故なのでしょうか？ また、スキムミルク溶液以外にはどのような条件を満たしているものが使用できるのでしょうか？ ウエスタンブロッティングの素朴な疑問 ウエスタンブロッティングの素朴な疑問 ウエスタンブロッティングなどでの泳動の際に、タンパク質サンプルを等量の2×sample bufferで希釈しますよね。その時に、普通のサンプルは綺麗な青色になるのですが、まれに濁った青色のものがあります。なぜなのでしょうか。また、実験への影響はあるのでしょうか。ご存知の方おりましたら… Western blotting について ラット大腸粘膜をスクレイプしたサンプルを用いてWestern blottingを行っています。 現在、β-catenin (Cell signaling #9562 Rabbit poly)の検出をトライしているのですが、Positive controlのβ-actin(SIGMA Mouse mono)は発光30秒でしっかりバンドが確認できますが、肝心のβ-cateninは10分発光しても全くバンドが出現しません。 ウェルに注入するサンプルはタンパク量10μgで10μl前後です。 ブロッキングは5%スキムミルクで一晩、 １次抗体は添書通りの1;1000の希釈で室温60分、 β-cateninの２次抗体にはABR社のDonkey Anti Rabbit HRPを用いて、添書では1:2500の希釈を1:1500で室温60分反応させています。 発光にはECLを用いてLAS-1000 plusで撮影しています。 Western blottingの経験がほとんどないため、どこから改善していくべきか教えてください。 メンブレンは冷凍保存しています。 ウエスタンブロッティングで １－細胞を免沈したものをウエスタンのサンプルとして使うとき、フリーズしておいたものを使うのですが、それを溶かす熱処理は５０～６０℃位のお湯で溶かして使ってます。 この時熱がサンプル内の蛋白に悪影響が及ぶことはあるのでしょうか？あまりに熱すぎるお湯だとよくないですよね？ ２－ブロッキングはスキムミルクをBufferで５％にして使ってますが、スキムミルクでブロッキングされるメカニズムを教えてください ３－ブロッティングの際メンブレンは素手ではもちろん触りませんが、ゲルを重ねる時は素手です； 皆手袋をしてやっているのですが、やはり素手ではよくないでしょうか？結果に影響が出たことはまだありませんが・・ケラチン等がついているのかな？と。 質問が基本的かつ多くて申し訳ありませんが、まだ知識が足りないところがあったので気になりまして、本にも載っていないので教えてください！ ウェスタンブロッティングのトラブルシューティング 学生で、3か月ほどウェスタンブロッティングをしています。 最近困っていることがあり、見たいバンドは出ているのですが、それと同時にメンブレンの左上から右下にかけて帯状の影が出てしまいます。 バンドは出ているので、手技の中で何かしらのミスを犯しているのだと思っているのですが、どこで犯しているのかがわかりません。 お分かりになる方がいらっしゃいましたら、お教え願います。よろしくお願いします。 【実験】ウエスタンブロッティングの二次抗体について 学部4回生で日々実験を行っています ウエスタンブロッティングは一次抗体を特異的に認識する二次抗体を標識にするのが一般的ですが なぜ一次抗体自体を標識にするのが一般的ではないのですか？ 標識済一次抗体が高価であることはすぐに思いつくのですが、 それ以外の理由が思いつきません。 ご回答よろしくお願いします。。。 ウエスタンブロッティングについて いつもお世話になっております。 先日ウエスタンブロッティングを行った所、メンブレンに全くトランスファーされていませんでした。その前日に行った時はしっかり出来ていたのですが・・・。 メンブレンとゲルの置く方向は間違っておらず（確認済み）、唯一違うとしたらバッファーのみ新しく作ったものでした。しかし、通電中に装置内に気泡が出ていたので、通電を確認していました。 そこで原因として考えられる点は、電極の差し違え（発電装置？側の）によって電流が逆に流れてしまったことによるのではないか、と考えているのですが、少し新しく作ったバッファーの事が気になっています。 そこでお聞きしたいのですが、もし、バッファーの組成が悪かった場合、装置の発熱なしにこの様なトランスファーだけが出来ない、なんて事はありえますでしょうか。大変くだらないのですが、どうも頭の片隅にひっかっかってしまってしょうがありません。 因みに、Prestain(BIO-RAD社製)もゲルに流しているのですが、ウエスタン終了後、ゲル内の色素は抜けており、メンブレンには移っていませんでした。（このことを考えると逆に流れてしまったという考え方が一番考えられそうですが・・・。） 装置はタンク式で、バッファーは10ｘtransfer buffer(250mMTris-base 1920mMグリシン;1L)を1ｘに希釈し、20％メタノールと混合したものを使用しています。 大変くだらない質問をしてしまって本当に申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願いいたします。 ウエスタンブロッティングの画像解析ソフトを探しています。 ウエスタンブロッティングの画像解析ソフトを探しています。 メンブレンからフィルムに感光させた後に、 バンドの濃さを定量するおすすめのソフトはありますでしょうか？ よろしくお願いします。 western blotting のマスキングについて リン酸化タンパク質を認識する抗体を用いてwestern blottingを 行おうとしたところ、誤ってマスキング剤としてスキムミルクを 使ってしまいました。膜を浸した後でBSAのほうが適切だったと 気づいたのですが、スキムミルクによるマスキングは抗体はずし用 のバッファー（私のラボでは市販のリプロービングバッファーを使っています）で除去できるでしょうか？もしできるのであれば、反応 条件を教えていただきたいです。 通常、リプロービングの際はマスキングし直してから再度抗体反応 を行うのである程度は除去されているとは思うのですが、リン酸化 抗体で反応しない程度かどうかが知りたいです。 ウエスタンブロッティングについて。 電気泳動して、ブロッティングして、抗体反応させて、いざバンドの検出をしたら、 １２０ｋＤに出るはずのバンドが、１００ｋＤに出てしまいました。 すごく濃く出ているバンドなので、その目的のバンドなんだと思いますが。。。 こういう現象って起こりますか？ またなにが原因なんでしょうか？ わかる方いましたら教えてください。 条件は、 ・Bis-Trisゲル。 ・ブロッティングはうまくいっています。 ・マーカーはAll Blue StandardとMagic Mark XP。ふたつのマーカーの位置を定規ではかってあわせるとほぼ同じ。 ・しかし、Magic Mark XPのバンドが見本以外の部分にもたくさん出て割れています。。。 ・二次抗体はanti-rabbitのもの。anti-mouseだとMagic Mark XPが割れることはない。 ウエスタンブロッティングで使う、塩濃度の違ったバッファーはメンブレンへ ウエスタンブロッティングで使う、塩濃度の違ったバッファーはメンブレンへのタンパクの転写を良くすると本に書かれてあったのですが、具体的な原理が書かれておらず、疑問に思っています。ご存知の方いらっしゃいましたらお教えください！ ブロッティングについて 現在、ウェスタンブロッティングを用いて実験を行っています。 皆様のご意見などを参考にさせて頂きたいと思い、投稿させていただきました。 以下の点について皆様のご意見をお聞かせ頂ければ幸いです。 ブロッティング時の電圧 当方では現在ブロッティングをATTO社のブロッティング装置を用いてセミドライ式で行っております。 ブロッティング条件は、「定電流150mA、時間60min、ゲルサイズ9cmx9cm」で行っております。 その際に電圧が、開始30V程から終了60V程まであがってしまいます。濾紙や膜は30分以上バッファーに浸けています。 これはやはり電圧が高すぎるでしょうか。 (参考書では定電圧で２５～３５Vとなっている為) 原因として考えているのは、「装置に濾紙を重ねるさいに濾紙を持ち上げても水滴が 落ちないくらいまで水気をきり、重ねる際には特にバッファーをかけていないため濾紙の 水気をきり過ぎている」のではと考えています。皆さんはどの程度の電圧でされていますでしょうか。 長々と失礼いたしました。至らない文章でわかりにくいとは思いますが、よろしくお願い致します。 Western blotting -バンドがすべて２重に出る- 現在、Western blottingをやっています。 目的のタンパクと陽性コントロールとしてβ-actinを反応させています。 目的タンパクもβ-actinもしっかりバンドが出るのですが、どちらとも２本線で出てくるのです。別のタンパクでやっても同様の結果でした。 原因として、 (1)１年以上前に購入した市販のゲルを使っているから (2)泳動時の電流／電圧が高すぎて分離しきれていないから (3)目的以外のタンパクも反応しているから などと考えましたが実際どうなのでしょうか。教えてください。 ウエスタン 蛋白 濃縮 ウエスタンブロッティングで、タンパク濃度が薄いため濃縮してから泳動したいのですが、濃縮するにはどうしたらよいのでしょうか。 ウェスタンとCBB染色のマーカーについて ウェスタンブロッティングとCBB染色でタンパク質のバンドの位置が異なります。 私は分子量22kDaのタンパク質を扱っているのですが、SDS-PAGE後CBB染色をするとマーカーの20kDaよりも下にバンドが出てきます。 しかし、SDS-PAGE後ウェスタンブロッティングすると、普通に20kDaより上にバンドが出るようになります。 それぞれ使っているマーカーは異なるのですが、こんなにもずれが生じるものなのでしょうか。 ノーザンブロッティングとは？ ちょっと困ってます。もってる資料が少なすぎて＆専門用語が理解不能でノーザンブロッティングがいまいちよくわかりません。教えてください。もしくは詳しく（わかりやすく）説明してくれているサイトを紹介してくださいm(_ _)m 注目のQ&A 「前置詞」が入った曲といえば？ 緊急性のない救急車の利用は罪になるの？ 助手席で寝ると怒る運転手 世界がＥV車に全部切り替えてしまうなら ハズキルーペのCMって…。 全て黒の5色ペンが、欲しいです 長距離だったりしても 老人ホームが自分の住所になるのか？ 彼氏と付き合って2日目で別れを告げられショックです 店長のチクチク言葉の対処法 カテゴリ 学問・教育 自然科学 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