Western Blotting

質問

近々Western Blottingをやります。
その際、目的蛋白質と一緒にα-チューブリンなどの内部標準蛋白（？）もBlottingできますか？
また、２次抗体が、例えばマウスとラビットで異なっていても同時にBlottingできますか？
抗体染色のときは異なる２次抗体を使って染色するので、Western Blottingでも大丈夫な気がするのですが、回りにやったことがある人がいないので分かりません。
論文に載っているような内部標準はどうやって出しているのでしょうか？
別々に作っているのでしょうか？

回答No.1

noname#17364 · ベストアンサー

こんにちは。
　anti-目的タンパクと、anti-内部標準の一次抗体は別の種由来か、アイソタイプがかぶらないようにします。それぞれ当てて、それぞれ二次抗体でvisualizeするという考え方で良いと思います。
　ただ、実際にはどっちから先に当てるかとか、時間とか、いろいろ試行錯誤するしか無いと思います。

　anti-内部標準については（anti-目的タンパクも、あれば）たぶんHRP標識済みのが売っていると思うので、それを使った方が良いですよ。標識１次抗体のほうがビシッときれいです。手順もすこしすっきりするし。

　同時visualizeが難しそうな場合はstirppingして同じメンブレンに当て直せば、流した蛋白量の標準化を行うことは出来ます。実験目的に合わせて試してみてください。

お礼

こんにちは。
早速の回答、どうもありがとうございました。

内部標準と目的蛋白は別の種由来の抗体が研究室にあるみたいです。
ただ、先輩は同時にBlottingしたことはないそうです。
抗体をそれぞれ当てて、ということは、同時に当てることはできないということでしょうか？
とりあえず、別々に当てれば同じメンブレンで目的蛋白と内部標準のバンドは見られるということですね？
strippingというのはひとつのレーンを半分に切るということで合ってるのでしょうか？？

また質問になってしまってすみません。
自分でも調べてみてるのですが。。。

回答No.2

fujishiro

目的タンパクのサイズはどれぐらいですか。

サイズが違えば、ブロッティング後、あるいはブロッキング後にPVDF膜を切るという方法もありますよ。
例えば、目的タンパクのサイズが30KDなら40KDぐらいのところで真横に切って、上側はチューブリン、下側は目的タンパクの一次抗体というふうに。
この方法ですと種がかぶっても大丈夫ですよ。サイズがかぶるとだめですが。
慣れると一枚を5枚にも6枚にも切り取る人もいますよ！
最近では、あいはぎができるメンブレンも出ていますよ。高いですが。

ちなみに抗体は混ぜないほうがよいですよ。ノンスペもまざることもありますので。

染色というのは、AP発色かなにかですか？
その方法ですとストリッピングは無理ですね～。
ストリッピングというのは抗体を引っぺがし違う抗体を当てなおす方法ですから。発光してカメラかフィルムで検出する方法ではよく使いますよ。

工夫しだいで一回の泳動とブロッテイングで多くのものを見ることができます。

お礼

ていねいな説明、どうもありがとうございました。

ストリッピングすれば、メンブレンは何度でも使えると言うことなので、メンブレンは切らずに、一度目的蛋白質を検出した後に、標準蛋白質に対して当てなおそうと思います。

染色と言うのは、ウェスタンブロッティングとは関係ないです。
以前別の研究室にいたときに、組織を免疫染色する際、２つの抗体を同時に混ぜて使っていたので、ウェスタンブロッティングでも同じなのか質問してみたという次第です。