ウエスタンブロッティングで

質問

１－細胞を免沈したものをウエスタンのサンプルとして使うとき、フリーズしておいたものを使うのですが、それを溶かす熱処理は５０～６０℃位のお湯で溶かして使ってます。

この時熱がサンプル内の蛋白に悪影響が及ぶことはあるのでしょうか？あまりに熱すぎるお湯だとよくないですよね？

２－ブロッキングはスキムミルクをBufferで５％にして使ってますが、スキムミルクでブロッキングされるメカニズムを教えてください

３－ブロッティングの際メンブレンは素手ではもちろん触りませんが、ゲルを重ねる時は素手です；　皆手袋をしてやっているのですが、やはり素手ではよくないでしょうか？結果に影響が出たことはまだありませんが・・ケラチン等がついているのかな？と。

質問が基本的かつ多くて申し訳ありませんが、まだ知識が足りないところがあったので気になりまして、本にも載っていないので教えてください！

回答No.1

gon99 · ベストアンサー

1.植物をつぶして取るときは70℃くらいまでやる場合がますが、なるべく低い温度で、短時間にするのがいいと思います。使うタンパク次第です。

2.メンブレンにはタンパクなら何でもくっ付いてしまうので、サンプルをくっ付けたあと、サンプルがくっ付いていないところをスキムミルクのたんぱくをくっつけて覆っているのだと思います。そうしないと抗体が全体にくっ付いてしまうので。抗体を加えるときにも入れるのは、抗体の保護の役目も果たしているのかもしれません。

3.肌はタンパク質の塊（しかもとれやすい）なので素手は良くないと思います。何かあったとき問題なので。

お礼

ありがとうございました。今度から手袋着用で行きたいと思います！
２はなるほどという感じでした！

回答No.2

snif

1.サンプルを冷凍する場合、冷凍は急速に、解凍はじっくりとみたいなことを聞いたことがあります。

２、メンブレンはタンパク質がとてもくっつきやすい膜です。だから泳動ゲルからタンパク質を転写できるのです。スキムミルクで処理するのは、他のタンパクが付くのを防ぐためです。よくわからないタンパクが付くかもしれないなら、いっそのことわかっているタンパク質をくっつけておこうというものです。しかも、もしスキムミルクで処理しなかったら、余分なタンパク質が付くだけでなく、抗体もタンパク質なのでメンブレンに付着してしまいます。目的のタンパク質に標識抗体をくっつけて、そのタンパク（抗原）の有無をみようというのがウエスタンブロットなのに、ブロッキングをしなかったらその標識抗体はメンブレンにくっつき放題で、そこら中が発色なり発光なりしてしまい、目的のタンパク質があるかどうかの判断なんてできなくなります。

３、というわけで、とにかくメンブレンはタンパク質と結合しやすいのです。ゲルに皮膚タンパクがつき、それも一緒になって転写されることもあるでしょう。他にも、皮膚タンパクがメンブレンに付着してしまう可能性は多く考えられます。手からの余分なタンパク質の混入を避けるのであれば、手袋は必須です。触らなくても、目に見えない垢として、メンブレンに皮膚タンパクに結合することだって考えられるのですから。
ゲルから転写したタンパク質以外のタンパク質の混入は避けるべきで、混入する可能性は極力排除すべきです。そうしないと、きちんとした結果はえられません。

お礼

きちんとした結果を得るには手袋が大事。ということが身にしみました。
ありがとうございました！