ウエスタンブロッティングについて。

質問

電気泳動して、ブロッティングして、抗体反応させて、いざバンドの検出をしたら、
１２０ｋＤに出るはずのバンドが、１００ｋＤに出てしまいました。
すごく濃く出ているバンドなので、その目的のバンドなんだと思いますが。。。

こういう現象って起こりますか？
またなにが原因なんでしょうか？
わかる方いましたら教えてください。

条件は、
・Bis-Trisゲル。
・ブロッティングはうまくいっています。
・マーカーはAll Blue StandardとMagic Mark XP。ふたつのマーカーの位置を定規ではかってあわせるとほぼ同じ。
・しかし、Magic Mark XPのバンドが見本以外の部分にもたくさん出て割れています。。。
・二次抗体はanti-rabbitのもの。anti-mouseだとMagic Mark XPが割れることはない。

回答No.2

Dr_Hyper

ゲルの組成は結構泳動度に影響したりします。
マーカはアミノ酸の組成が違うので、gel のpHなどによって影響を受けますので、組成に関しては一度ご確認ください。
あとよくあるのがsample bufferです。DTTを使用するかbeta-メルカプトエタノールを使用するかでも変わってくる場合があります。
膜レセプターの場合boilの方法でも変わってくる可能性があってやっかいなところです。
例えばSDSで全タンパク質を流して比較されたことありますか？
もしかしたらタンパクの抽出が悪くて流せてない可能性があります。
メンブレンにたまたま弱く反応できるタンパク質が100KDaに会ったと言うだけかもしれませんからね。

お礼

回答ありがとうございます。

ゲルのpHもいろいろ条件変えてみたらうまく出るかもですね。
一次抗体の感度も、マーカーと抗体の相性も悪そうです。。。
sample bufferの組成ですか、
今はメルカプトエタノールを使っていますが、
前任者は他の大学のため、違うかもしれないので確認してみたいと思います。
まだまだ未熟なためタンパク抽出に問題があるかもですよね。。。
がんばって検討したいと思います！

回答No.1

Dr_Hyper

もしお力になれるようでしたら以下の質問にお答えください。
1.　泳動したサンプルはなに？（細胞抽出液とかリコンビナントとか、組織、塩濃度、タンパク量）
2.　westernしてバンドが120KDaになる根拠は？
3.　１、２に関係しますが、文献など報告があるばあいには条件が違う箇所は
4.　100KDaのバンドがシャープに出ていて、そのバンドと同じ高さになってしまうと言うことですか？
マーカーが太くて、目的のバンドが細かったら正しいサイズがわからないですよね。。。
以上の情報があれば少しはお役に立てるかもしれません、
ご質問のみでしたら

分子量が計算上であればその程度の違いはあり得る。
抗体が濃く出るからと言ってノンスペでは無いと言い切れない
プロセシングを受ける。
細胞種特異的なバリアントがある
いろいろ経験はありますが、とりあえずはこの辺で。

お礼

回答ありがとうございます☆

補足ですが、
１．泳動したのはラット肝の核分画のみ除いた上清(タンパク)
２．１次抗体(モノクローナル)のデータシートより。
３．データシートに詳細な条件はありませんでしたが、前任の方の結果は同じ抗体で120ｋＤに出ていました。
しかしゲルの組成が、Bis-Tris⇔Trisの違いでした。(プロトコルの書き間違えのおそれもありますが。。。)なので、今Trisのゲルでやっています。
４.マーカーは、100も120も両方バンドがあって、両方はっきり出ていて、100と同じ高さにバンドが出ている状況です。目的タンパクのバンドもわりと太くでてます。

まだ未熟なため、操作に問題があった可能性もありますが、何回やっても、100ｋＤになってしまうんです。
また知識もなく、プロセシングを受けてしまう原因などもよくわからなぃのですが。。。

なにかまたありましたらよろしくお願いいたします。