ベストアンサー ウエスタンブロッティングの画像解析ソフトを探しています。 2010/05/11 20:41 ウエスタンブロッティングの画像解析ソフトを探しています。 メンブレンからフィルムに感光させた後に、 バンドの濃さを定量するおすすめのソフトはありますでしょうか？ よろしくお願いします。 みんなの回答 （1） 専門家の回答 質問者が選んだベストアンサー ベストアンサー Drgorilla ベストアンサー率44% (52/116) 2010/05/12 00:45 回答No.1 ImageJのAnalyze>Gels。 画像解析ソフトは数値は出してくれますが、それが（特にウェスタンブロッティングとかは）適切な解析方法かどうかは別なので気をつけてください。 ImageJ; http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html 使い方；http://www.hm6.aitai.ne.jp/~maxcat/imageJ/menus/analyze.html 広告を見て全文表示する ログインすると、全ての回答が全文表示されます。 通報する ありがとう 0 カテゴリ 学問・教育自然科学生物学 関連するQ&A ウェスタンブロッティングのトラブルシューティング 学生で、3か月ほどウェスタンブロッティングをしています。 最近困っていることがあり、見たいバンドは出ているのですが、それと同時にメンブレンの左上から右下にかけて帯状の影が出てしまいます。 バンドは出ているので、手技の中で何かしらのミスを犯しているのだと思っているのですが、どこで犯しているのかがわかりません。 お分かりになる方がいらっしゃいましたら、お教え願います。よろしくお願いします。 Western blotting について ラット大腸粘膜をスクレイプしたサンプルを用いてWestern blottingを行っています。 現在、β-catenin (Cell signaling #9562 Rabbit poly)の検出をトライしているのですが、Positive controlのβ-actin(SIGMA Mouse mono)は発光30秒でしっかりバンドが確認できますが、肝心のβ-cateninは10分発光しても全くバンドが出現しません。 ウェルに注入するサンプルはタンパク量10μgで10μl前後です。 ブロッキングは5%スキムミルクで一晩、 １次抗体は添書通りの1;1000の希釈で室温60分、 β-cateninの２次抗体にはABR社のDonkey Anti Rabbit HRPを用いて、添書では1:2500の希釈を1:1500で室温60分反応させています。 発光にはECLを用いてLAS-1000 plusで撮影しています。 Western blottingの経験がほとんどないため、どこから改善していくべきか教えてください。 メンブレンは冷凍保存しています。 ウエスタンブロットでのフィルム感光について ウエスタンブロットを行い、メンブレンに転写し、ブロッキングしたあと、 フィルムに感光してバンドを確認してるのですが、その際、バックグラウンドが 濃くなり、バンドがきれいに見えません。何かいい方法はないでしょうか。 メンブレンのメーカーや種類が関係してるのでしょうか？メンブレンはニトロセルロースで、アドバンテックを使用してます。 よろしくお願いします。 天文学のお話。日本ではどのように考えられていた？ OKWAVE コラム ウエスタンブロッティング法のブロッティングについて ウエスタンブロッティング法のゲルからブロッティン紙にブロッティングする際に、3回に1回ぐらいブロッティン紙の一部がちょっと透けたようにみえることがあり、このときは決まってうまくいきません。（バンドが出ず、でても相当薄いです）時間が長すぎるのでしょうか？どこが悪いのか教えてください。 ブロッティングの時間は1時間45分で200V,200mAで行っています。紙は、milliporeのimmunobilonを使用しており、wet法でやっています。 ウエスタンブロッティングについて いつもお世話になっております。 先日ウエスタンブロッティングを行った所、メンブレンに全くトランスファーされていませんでした。その前日に行った時はしっかり出来ていたのですが・・・。 メンブレンとゲルの置く方向は間違っておらず（確認済み）、唯一違うとしたらバッファーのみ新しく作ったものでした。しかし、通電中に装置内に気泡が出ていたので、通電を確認していました。 そこで原因として考えられる点は、電極の差し違え（発電装置？側の）によって電流が逆に流れてしまったことによるのではないか、と考えているのですが、少し新しく作ったバッファーの事が気になっています。 そこでお聞きしたいのですが、もし、バッファーの組成が悪かった場合、装置の発熱なしにこの様なトランスファーだけが出来ない、なんて事はありえますでしょうか。大変くだらないのですが、どうも頭の片隅にひっかっかってしまってしょうがありません。 因みに、Prestain(BIO-RAD社製)もゲルに流しているのですが、ウエスタン終了後、ゲル内の色素は抜けており、メンブレンには移っていませんでした。（このことを考えると逆に流れてしまったという考え方が一番考えられそうですが・・・。） 装置はタンク式で、バッファーは10ｘtransfer buffer(250mMTris-base 1920mMグリシン;1L)を1ｘに希釈し、20％メタノールと混合したものを使用しています。 大変くだらない質問をしてしまって本当に申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願いいたします。 ウエスタンブロッティングで １－細胞を免沈したものをウエスタンのサンプルとして使うとき、フリーズしておいたものを使うのですが、それを溶かす熱処理は５０～６０℃位のお湯で溶かして使ってます。 この時熱がサンプル内の蛋白に悪影響が及ぶことはあるのでしょうか？あまりに熱すぎるお湯だとよくないですよね？ ２－ブロッキングはスキムミルクをBufferで５％にして使ってますが、スキムミルクでブロッキングされるメカニズムを教えてください ３－ブロッティングの際メンブレンは素手ではもちろん触りませんが、ゲルを重ねる時は素手です； 皆手袋をしてやっているのですが、やはり素手ではよくないでしょうか？結果に影響が出たことはまだありませんが・・ケラチン等がついているのかな？と。 質問が基本的かつ多くて申し訳ありませんが、まだ知識が足りないところがあったので気になりまして、本にも載っていないので教えてください！ ウエスタンブロッティングで使う、塩濃度の違ったバッファーはメンブレンへ ウエスタンブロッティングで使う、塩濃度の違ったバッファーはメンブレンへのタンパクの転写を良くすると本に書かれてあったのですが、具体的な原理が書かれておらず、疑問に思っています。ご存知の方いらっしゃいましたらお教えください！ CBB染色について SDS-PAGEした後にウェスタンブロッティングに用いるはずだった メンブレンを誤ってCBB染色してしまいました。このメンブレンを もう一度ウェスタンブロッティングに用いることは可能でしょうか？ 可能でしたらその適切な方法も含めて教えてください。 ウェスタンブロットに使うX線フィルムについて どこに質問していいのか分からず、行っている実験が生物学的なことなので、こちらに書かせていただきました。 私は実験でウェスタンブロット法を用いていますが、先日そこで用いているX線フィルムを暗室で感光させてしまったらしく、かなりこっぴどく怒られてしまいました。 そこで質問ですが、X線フィルムを感光させてしまった場合、その感光したものだけが使えなくなってしまうのか、その感光させたことを気付かずに他の感光していないフィルムと一緒にした場合、その他のものも駄目になってしまうのか、よく分からないのでよろしくお願いします。 ウェスタンブロットについて トラブル ここ２ヶ月ほどウェスタンブロッティングしたおります。しかし、現像してもバンドが5回に1回にポジコンマでもが全く検出できなくなります。ミルクは５％スキムミルク、０．１％牛アルブミン、PBS-TでｐH７．４にし、一次抗体、２次抗体の濃度は間違っておらず、最後のECLの濃度も間違っていません。メンブレンにちゃんと転写されているかの確認（ポンソー染色にて）行ったところちゃんと転写されていました。原因が分からず本当に困っております。どなたか分かられる方教えてください ウェスタンとCBB染色のマーカーについて ウェスタンブロッティングとCBB染色でタンパク質のバンドの位置が異なります。 私は分子量22kDaのタンパク質を扱っているのですが、SDS-PAGE後CBB染色をするとマーカーの20kDaよりも下にバンドが出てきます。 しかし、SDS-PAGE後ウェスタンブロッティングすると、普通に20kDaより上にバンドが出るようになります。 それぞれ使っているマーカーは異なるのですが、こんなにもずれが生じるものなのでしょうか。 western blotting のマスキングについて リン酸化タンパク質を認識する抗体を用いてwestern blottingを 行おうとしたところ、誤ってマスキング剤としてスキムミルクを 使ってしまいました。膜を浸した後でBSAのほうが適切だったと 気づいたのですが、スキムミルクによるマスキングは抗体はずし用 のバッファー（私のラボでは市販のリプロービングバッファーを使っています）で除去できるでしょうか？もしできるのであれば、反応 条件を教えていただきたいです。 通常、リプロービングの際はマスキングし直してから再度抗体反応 を行うのである程度は除去されているとは思うのですが、リン酸化 抗体で反応しない程度かどうかが知りたいです。 日本史の転換点？：赤穂浪士、池田屋事件、禁門の変に見る武士の忠義と正義 OKWAVE コラム Western blotting->発色させた後の膜でアミノ酸配列読める？ Western blottingし、（POD法等で）発色させた後のPVDF膜で、アミノ酸配列は読めるでしょうか？ もしもこれが出来たら、検出されたバンドのタンパクのN末配列が判って便利なのに...。 ブロッキングに使ったタンパクや抗体タンパクの方の量が多いだろうから、絶対に不可能なんでしょうか。 （抗体の方は剥がせるにしても、ブロッキング試薬の方は...。） トライした事のある人、いませんか？ Western blotting -バンドがすべて２重に出る- 現在、Western blottingをやっています。 目的のタンパクと陽性コントロールとしてβ-actinを反応させています。 目的タンパクもβ-actinもしっかりバンドが出るのですが、どちらとも２本線で出てくるのです。別のタンパクでやっても同様の結果でした。 原因として、 (1)１年以上前に購入した市販のゲルを使っているから (2)泳動時の電流／電圧が高すぎて分離しきれていないから (3)目的以外のタンパクも反応しているから などと考えましたが実際どうなのでしょうか。教えてください。 WBについて（基本的なこと） Western blottingについて聞きたいことがいくつかあります。 ・ECLなどをメンブレンにしみこませ、発光（ケミルミ）させると反応が強すぎて「サチる」と言われる状態になりますが、この「サチる」ってなんのことですか？何故そうなるのですか？何故サチるという言葉なのですか（何かの略語ですか）？ ・バンドが出たときに強すぎて中が抜けたようになってしまうことがあるのですが、これは何故ですか？「発色気質が強すぎる」とか言われたのですが、なんのことやら・・でした。 教えてください！よろしくお願いします。 ウェスタンブロットの検出で 題字の如くなのですが、HAタグをつけた融合タンパク質をサンプルに泳動後、ウェスタンブロットでanti-HA mouse IgGで検出するという実験を行いました。二次抗体はanti-mouse IgG HRP conjugatedです。 しかし、抗体処理後にアマシャム社のECLキットを用いて発色操作をしたところ、今まで何もなかったメンブレン上に茶色いバンドが出現しました。これは目的のタンパク質が多量に発現しているのだろうと思い、LAS-1000イメージアナライザーでバンドを検出しましたら、メンブレン上に見えていたバンドの位置に全くバンドが検出されませんでした。 怪しいところと言うと、抗体処理、あるいはブロッキングの段階が考えられますが、メンブレン上にバンドが見えるのに、それを読み取れなかったと言う経験をお持ちの方、いらっしゃいましたら考えられそうな原因を何でもいいので教えて下さい。お願いします。 SDSやELISAなどの違いについて たんぱく質などの定量や定性に用いられるものにSDSやELISA、ウエスタンブロッティング、サザンブロッティング法などがあると思うのですが、それぞれ主にどのような違いがあって、それぞれ用い方がことなるのでしょうか？ また、これらの方法の他にどのようなたんぱく質などの定量や定性法があるのでしょうか？ ImageJの使い方についてお教え下さい ImageJを使ってフィルム上のウェスタンブロットのバンドを定量解析する際のご質問です（2つございます）。添付画像の上の写真のようなバンドを解析しておりますが、バンドが太く、隣のバンドとくっついています。 自分のいつものやり方では、細長い四角形で一番左側を囲んで、Analyze→Gels→Select First Laneで確定した後、隣のレーンにずらしてSelect Next Laneで確定し、すべてを確定した後、Prot Laneで表示し、出てきた山の底辺と思われるところに線を引いて、魔法の杖で山の面積を数値化したものをバンドの定量値としております。その際、図のようにバンドが隣と重なり、更にレーンの幅が異なる場合、最初に確定した四角形を隣にずらしただけでは、別のレーンのバンドにも四角形がはみ出るため、正確に数値化できません。(1)途中で四角形の幅を変更することもできないようですが、このような場合にはどのように調整をしたら宜しいでしょうか？(2)また左から5番目のように非特異なバンドが解析対象バンドのすぐそばにある場合、添付画像の下の図の通り、どこが底辺かわからないような山が出てきます。左の大きい山が解析対象の山ですが、すぐ隣の山との境目のところから真下に線を引いてアバウトな境界を作ってそこまでを解析対象の面積を見なしても宜しいでしょうか？本来ならブロットのフィルムの方をベストの解析しやすいコンディションにするべきでしょうが、今回のケースにはいつも頭を悩まされています。具体的な解決方法がございましたら、ぜひともご教示をお願い申し上げます。 二次元電気泳動でのおすすめ画像解析ソフト タンパク質の二次元電気泳動画像解析ソフトで、おすすめのものは何でしょうか。多機能でなくていいのですが、安価なもので・・。 また、フリーソフトでそのようなものはないでしょうか。 教えてください。 ゴルフの解析ソフトについて教えてください。 お世話になります。 ゴルフスウィングの解析ソフトを探しています。 ビデオカメラで動画を取り、スウィングの分析ができるソフトを探しています。画像がきれいなものを希望しています。 何かお勧めのソフトがあれば教えてください。 宜しくお願いします。 注目のQ&A 「You」や「I」が入った曲といえば？ Part2 結婚について考えていない大学生の彼氏について 関東の方に聞きたいです 大阪万博について 駅の清涼飲料水自販機 不倫の慰謝料の請求について 新型コロナウイルスがもたらした功績について教えて 旧姓を使う理由。 回復メディアの保存方法 好きな人を諦める方法 小諸市（長野県）在住でスキーやスノボをする方の用具 カテゴリ 学問・教育 自然科学 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