ウエスタンブロッティングについて

質問

いつもお世話になっております。

先日ウエスタンブロッティングを行った所、メンブレンに全くトランスファーされていませんでした。その前日に行った時はしっかり出来ていたのですが・・・。
メンブレンとゲルの置く方向は間違っておらず（確認済み）、唯一違うとしたらバッファーのみ新しく作ったものでした。しかし、通電中に装置内に気泡が出ていたので、通電を確認していました。
そこで原因として考えられる点は、電極の差し違え（発電装置？側の）によって電流が逆に流れてしまったことによるのではないか、と考えているのですが、少し新しく作ったバッファーの事が気になっています。
そこでお聞きしたいのですが、もし、バッファーの組成が悪かった場合、装置の発熱なしにこの様なトランスファーだけが出来ない、なんて事はありえますでしょうか。大変くだらないのですが、どうも頭の片隅にひっかっかってしまってしょうがありません。
因みに、Prestain(BIO-RAD社製)もゲルに流しているのですが、ウエスタン終了後、ゲル内の色素は抜けており、メンブレンには移っていませんでした。（このことを考えると逆に流れてしまったという考え方が一番考えられそうですが・・・。）
装置はタンク式で、バッファーは10ｘtransfer buffer(250mMTris-base 1920mMグリシン;1L)を1ｘに希釈し、20％メタノールと混合したものを使用しています。

大変くだらない質問をしてしまって本当に申し訳ありませんが、どうぞよろしくお願いいたします。

回答No.3

lamb1204 · ベストアンサー

回答ではないんですが…。

>ひょっとしてTris-baseの粉末から作りましたか？高濃度（ふつうは1 M ）Tri-HCl pH 8.3 (pH 8.5前後、プロトコールによって異なるかも）のストック溶液を使ってください。(geneticist12)

初めて知りました。そういうことがあるんですね。当研究室では、ナカライのトリスを使用していますが、毎回粉末のトリスとグリシンから調製しています。むしろpH調整は「してはいけない」と聞いています。何がちがうのでしょうか？

それと回答としては、やはり逆に転写した可能性が高いのではないかと私は思います。電源装置への電極の差し違え、カセットの方向、転写装置のフタ（＝電極）の差し違え。間違う可能性のある箇所がいっぱいあります。

回答No.4

geneticist12

＞初めて知りました。そういうことがあるんですね。当研究室では、ナカライのトリスを使用していますが、毎回粉末のトリスとグリシンから調製しています。むしろpH調整は「してはいけない」と聞いています。何がちがうのでしょう

すみません。私の勘違いです。ご指摘ありがとうございます。
でも、できたバッファーのpHをチェックしてみてください。
なにか間違いがあればpH8.3前後から大きく外れていることでわかることがありますので。

回答No.2

geneticist12

＞タンパク質の正電荷が高くなりすぎてすっぽ抜けている可能性があります。
誤）正電荷
正）負電荷
です。

回答No.1

geneticist12

>バッファーは10ｘtransfer buffer(250mMTris-base 1920mMグリシン;1L)を1ｘに希釈し、20％メタノールと混合したものを使用しています。

ひょっとしてTris-baseの粉末から作りましたか？
高濃度（ふつうは1 M ）Tri-HCl pH 8.3 (pH 8.5前後、プロトコールによって異なるかも）のストック溶液を使ってください。粉末から作ると恐ろしく塩基性になっていると思われ、タンパク質の正電荷が高くなりすぎてすっぽ抜けている可能性があります。

また、わかっていると思いますが、1x にメタノールを加えるのではなく、10xを8分目まで水で希釈し残り2分目をメタノールです（10xストック1 vol, methanol 2 volを水で10 volに）。