Western blotting -バンドがすべて２重に出る-

質問

現在、Western blottingをやっています。
目的のタンパクと陽性コントロールとしてβ-actinを反応させています。
目的タンパクもβ-actinもしっかりバンドが出るのですが、どちらとも２本線で出てくるのです。別のタンパクでやっても同様の結果でした。
原因として、

(1)１年以上前に購入した市販のゲルを使っているから
(2)泳動時の電流／電圧が高すぎて分離しきれていないから
(3)目的以外のタンパクも反応しているから

などと考えましたが実際どうなのでしょうか。教えてください。

回答No.1

ADEMU · ベストアンサー

普通に考えると、反応はちゃんとしているので、ゲルが均一でない、それも厚さの中で（表面と裏側とで）ムラがあることが考えられます。
表面と裏側で伝導率が違うということ。
あとは、コームのサンプルチャージ部分が平らでなく勾配ができているか（でも、この場合は二重線というよりブロードになることの方が多いと思いますが）でしょうか。

回答No.2

geneticist12

＞(1)１年以上前に購入した市販のゲルを使っているから

３つの中ではこれがいちばん怪しいですね。そんなにもつものではないです。

さらに疑わしいのはサンプルバッファーのなかの還元剤が劣化していて、タンパク質が還元不足になっていること。作り置きしているものなら新たに作り直し。2-ME、DTTストック溶液が古いようなら、新しく買う、作り直す。

http://www.bio-rad.co.jp/B2B/BioRad/jsp/default.do?BV_SessionID=@@@@0533709311.1190642258@@@@&BV_EngineID=ccceaddmdjekhkicfngcfkmdhkkdfll.0&faq_id=FAQJP389&nextPage=BRTechFAQDisplayPage