native-PAGE

質問

実験でnative-PAGEを始めたのですが，バンドがきれいに出ません（スメア）．SDS-PAGEではきれいにバンドが出ています．

目的蛋白質はオリゴマーで等電点は7.2です．還元剤は入れずに泳動しています．

ゲルはSDS-PAGEで通常用いられている組成からSDSだけを除いています．具体的には，
15％アクリルアミドゲルで
濃縮ゲルはトリス-塩酸（pH 6.8，SDS-）
分離ゲルはトリス-塩酸（pH 8.8，SDS-）
泳動用緩衝液はトリス-グリシンです．

電流は18mAです．

native-PAGEは蛋白質の電荷で動くので，ゲルのpHとかに依存するのかなとも思うのですが，よく分かりません．

何か参考になるURLやアドバイス等ありましたら，教えていただけると幸いです．宜しくお願いします．

回答No.2

kgu-2

タンパクの分子量は?

昔々の記憶では、分子量が３０万を越えると、ゲルの中に入らない、・・・・。

回答No.1

96R

Native-PAGEは、泳動時のタンパク質の電荷と分子量、形態などが複雑に関わりあって
泳動します。
一般に、SDS-PAGEに比べてスメアーになりやすく、特に糖タンパク質などはタンパク質の
電荷が同じでも糖鎖部分が微妙に異なりこのようになる傾向が強いです。
この場合も、オリゴマーということでタンパク質部分は全く同じでもサブユニットの数や
付き方が変化して複数のちょっとずつ違ったタンパク質が生じているためにスメアーに
なっている可能性があります。
アドバイスですが、このような差を顕著に出さないために、ゲル濃度をもう少し
低くして分離をわざと悪くしてみてはいかがでしょうか？
ちなみに、うちの分離ゲル濃度は7.5%です。