western blotでのタンパクの発現

質問

私は、HeLa細胞に遺伝子を導入し（transfection)、それをサンプル化してwesternにかけています。しかし、まったくタンパクは発現せず抗体濃度をあげても、目的のバンドはおろかpositive controlも検出されませんでした。サンプルは全量200μlでこれに5×sample bufferを50μlいれてサンプル化し、それを20μlゲルに流し込み泳動しています。教授に聞くとHeLa細胞は発現があまりよくないと言っていましたが、positive controlさえでないのでどこが間違っているのかわかりません。詳しい方教えていただきたいです。よろしくお願いします。

回答No.2

Dr_Hyper · ベストアンサー

確認されたステップをもう少し細かく表現していただけるともう少し的を得た回答が出来るかと思います。

トランスファーはうまくいっているか。
prestain markerを使用するとこのステップの確認が簡単にできます。
そう出なければ染色などで確かめます。
抗体の濃度やwash bufferのpHは大丈夫か。
何度か使用された抗体でしょうか？

fusionということはFLAGまたはHAなどのtagを使っているのでしょうか？それであれば簡単に免疫沈降できるので濃縮は可能ですね。

補足

私が使用しているのは、virusのfusion（F)とhemagglutinin-neuraminidase(HN)タンパクです。この細胞でいくつかサンプルを使用していますがpositive controlとしてＦproteinとHNproteinの野生型を２つ一緒に、他はFの遺伝子組み換え型、HNは野生型を２つ一緒に導入し細胞融合を見る実験をしています。このとき確認できたのは、positive control(HNとFの2つを入れたもの）やその他のサンプルにおいてもHNのみのバンドしか検出されませんでした。DNA濃度は2つが等しくなるようにしています。（各3μgずつ）他のサンプルはともかく細胞融合を起こす野生型さえ検出できないのはおかしいと思いました。抗体は多少古いものを使用していますが、他の実験で使用したときにきちんとバンドが検出されているので問題ないと思います。tag（?)としてはproteinA-HRPを使用しています。実験初心者なのでうまく表現できなくてすみません。

回答No.1

boston4

transfectionに問題が無く、mRNAも出ているのですね？
その上で、
HEK細胞を使っても、発現量が低いものは検出できないことはよくあります。抗体を使って、免沈して濃縮したサンプルをアプライしてみてはいかがでしょうか？

膜タンパクですと、サンプル化するときの煮沸処理が致命的になることがあります。タンパク同士が凝集してきれいに可溶化されないのが原因です。そのような時は50度以上には温度をあげないのがコツです。私は室温で一晩放置なんてのもしたりします。

お礼

ありがとうございます。さっそくやってみます。私が扱っているのはFusion proteinの遺伝子なのでboston4さんのアドバイスを踏まえて慎重に行ってみようと思います。