膜タンパクの泳動

質問

ウエスタンブロッティングをやっているのですが、細胞膜にあるといわれている膜タンパクのバンドが出なくて困っています。
膜タンパクを泳動するには通常のサンプルバッファーでは溶けないことがあると聞き、今回もそれが原因ではないかと思っています。
膜タンパクをブロッティングしたいときは、どのようなサンプルバッファーで、どのように処理したら良いのでしょうか。教えていただけたら幸いです。
また、参考URL等がありましたらお願いします。

回答No.1

noname#71020 · ベストアンサー

まず、その”細胞膜にあるといわれている膜タンパク”の論文をあたり、彼らがどのような材料で、どのような手法を用いたのか調べるのが一番です。

具体的にどのような手法を試み、サンプルバッファーが問題との結論に至ったかわかりませんが…
一連のウェスタンブロッティング手法、特に使用している１次抗体がきちんとworkしていると仮定すると、

膜タンパクのウェスタンの際に多く問題となるのは、
目的タンパクがlysis bufferのdetergentで可溶化されないことです。
その場合、様々な種類のdetergentを含むlysis bufferを検討します。

可溶化を確認するには、
細胞回収→遠心し（通常のlysate回収）、上清＝lysateとは別に、 pelletにもsample bufferに溶かして電気泳動します。
samplebufferは10% SDSが含まれますので、たいていの膜タンパクは可溶化されると考えられます。

detergentなどの詳細は、大学図書館や研究室に常備されているような一般的なタンパク質実験書に載っていますよ。

補足

回答いただきありがとうございます。
アドバイスの通りpelletも泳動してみたところ、（非常に微量ですが）今まで出なかったバンドが出ました！
培養細胞ではなく、ラット組織から抽出しているのですが、同様な実験をした論文では、lysis bufferに10 mM Tris–HCl, 50 mM mannitolを使っていました。
このバッファーは今まで知りませんでしたが、mannitolを発注して次はこれでやってみようと思います。

回答No.4

mippo-

No.3の続きです。

＞超音波破砕はどのような利点があるのでしょうか？

細胞の破砕される強度が強いので、ピペッティッングのみでは可溶化できない分子も可溶化される可能性があります。
ただし、やりすぎると、タンパク質の変性や失活が起こり、
逆に沈殿してしまうこともあるので、破砕強度など予備検討が重要です。
電気泳動用のサンプルバッファー中で超音波破砕する場合は、
非常に泡立ちやすいので注意してください。

＞また、他の方法で代用できませんか？

うーん、同じくらいの破砕力をもった可溶化方法は、私は思いつきません。

お礼

なるほど、よく分かりました。
ありがとうございます。

回答No.3

mippo-

プロトコールが分からないので、なんとも言えませんが、
超音波破砕をやってみてはいかがでしょうか？

ウェスタンの検出系の感度は大丈夫ですか?
微量タンパク質なら、化学発光がよいかと思います。
もしくはサンプルのロードする量を増やすとか。
市販品などのポジコンがあれば、よいのですが。

補足

回答ありがとうございます。
超音波破砕はどのような利点があるのでしょうか？
また、他の方法で代用できませんか？
私の研究室には残念ながらありませんので、すぐ使うことはできません。。。（今他の研究室に問い合わせています）
知らないことばかりですみません。

回答No.2

otx

ウエスタンのサンプルバッファーで溶けないものは、かなりかなり特殊です。

なので、一度細胞を集めて、直接ウエスタンのサンプルバッファーで溶かして泳動したらどうですか？

簡単なことです。まずは四の五の言わずにやってみてからではないでしょうか？

私は、数多くの膜タンパク質をウエスタンしてきましたが、それで溶けなかった膜タンパク質って、少なくとも細胞膜では経験ありません。

お礼

ありがとうございます。
経験が浅いので、どうしても細かなところで悩んでしまいます。