大腸菌に組み込まれるTOPOベクターのコピー数について

質問

生命科学を勉強している大学生です。
まだまだ知識が足りないので、おかしなことを言っていたらすみません。

現在、実験でインビトロジェンのpCR2.1-TOPOベクターにインサートを組み込み、DH5-αT1へとトランスフォーメーションしているのですが
このベクターは大腸菌に入る際に、複コピー数入るのでしょうか？

コロニーのインサートを調べてみると、インサートの向きが違う２種類のベクターがトランスフォーメーションされたと思われる結果になってしまいます。

どなたか、よろしくお願いします。

回答No.1

miya_0726 · ベストアンサー

お使いのプラスミドベクターに限らず、大腸菌に形質転換する際は大量のプラスミドベクターが細胞内に入ります。
ところが、pCR2.1ですとColE1 oriを持っていると思いますが、このoriは同じoriを持つプラスミドベクター（同じものに対してであっても）に対して不和合性を示します。
従って、細胞内に入ったプラスミドのベクターのうち１つだけが複製でき、その他は複製できないため分裂に伴い存在比は減っていきます。
ですので、通常は仰られているような状況にはなりにくいです。

ご相談の状況ですと、まずはシングルコロニーピッキングがうまくいっておらず、種類の異なるプラスミドベクターを保持する大腸菌が混在しているのではないか？と思いますが、いかがでしょうか？
形質転換後にコロニーを白金耳か爪楊枝などでつついて拾ってきたと思いますが、その際に確実に単コロニーを拾ってきていますか？場合によっては２つのコロニーが合体して単コロニーのように見える場合もあります。

もう一度寒天培地に塗り広げて、再度複数個をそれぞれ培養し、プラスミドを取ってみるとよいかと思います。

お礼

ありがとうございます！さっそくのご回答とてもうれしいです。

>>不和合性
そういう言葉、教科書に載ってました。
もっと勉強します。

コロニーピックUPはうまくいってる自身があります。先輩に指導してもらいました。

インサートの確認は制限酵素処理で行いまして、その結果をみて２種類のベクターが入ってしまっていると勘違いしてしまったので
おかしな位置に出てきたバンドは酵素処理がうまく行かなかった可能性もあるので、もう一度試してみたいと思います。

今後も、よろしくお願いします(；^ω^)