制限酵素のバッファーについて

質問

制限酵素でPCRしたDNA配列をinsertとしてvectorに入れようとおもっています。
その際に2種類の制限酵素で切断しようと思っています。組み合わせはSapIとHindIII、SalIとHindIIIです。これらで同時に切断したいので、これらに適したBufferを教えて頂けると幸いです。
また、制限酵素二つで切断する際のバッファーの選び方があれば教えて頂きたく思います。
よろしくお願いいたします。

回答No.4

LIGHTSPEED

他の回答者さんのお勧めするNEBのサイトにある、double digestのバッファーの組み合わせ表はは使用頻度高いので、今後はまずそちらを見るのがいいかと思います。
二種類の酵素の組み合わせがバッファーの都合でよろしくないときは、一度片方で切って、フェノ抽して、エタ沈してからもう一方で切る方法をいつもしています。
最初のDNAのinputは多めに（フェノ抽でロスらない自信があればいいのですが）。

回答No.3

geneticist12

ちなみに、NEBのWebサイトでは、double digestのバッファーのサーチエンジンがあります。
http://www.neb.com/nebecomm/DoubleDigestCalculator.asp?

私は、二者の至適バッファーが違うときは、最初に至適塩濃度の低い方で１時間消化、次に塩の終濃度があうように10xバッファーまたは塩と水を加え、至適塩濃度高い方で1時間消化します。

一般的に至適塩濃度が低い酵素を、高い塩濃度で使うと切れなくなるだけですが、逆だとスター活性が生じる可能性があります。

また、塩としてNaClが推奨されるものとKClが推奨されるものがありますが、NaCl系の酵素をKClで使うとスター活性がでるものもあります。
私は、二重消化で使う酵素が両者にまたがる場合は、カタログ情報などで調べて、KClをNaClに変えてもある程度活性が保証されているならNaClでそろえます。そうでなければ、片方で消化した後EtOH沈殿でバッファー交換します。

それと、老婆心ですが
SapIは認識配列と切断箇所が違うので、SapIで切った断片同士は切断箇所の配列まで一致していないとくっつかないと思いますが、大丈夫でしょうか。

回答No.2

overthisgraysky

ＮＥＢのカタログの後ろの方にも、double digestion bufferについての表が載ってますよ。

回答No.1

panda_

タカラのカタログの冒頭、制限酵素のBufferのページに詳しく載っています。塩濃度が高いとスター活性が出る場合もありますので注意が必要です。