0.5XSSC溶液中でのＤＮＡのアニーリング

質問

下記のようなキットのマニュアルにないことをしようとすると不安になるダメな遺伝学者です。

ジェノミックライブラリ（ＰＣＲ後エタ沈済み、おそらく2本鎖）とBiotinylated-Oligoプローブを、0.5XSSC溶液中でアニーリングさせたいです。
両者を混ぜて、95℃で5分程度熱してＤＮＡを1本鎖にした後、室温で冷やせば、ＤＮＡとプローブはくっついてくれるでしょうか？

回答No.2

geneticist12 · ベストアンサー

できると思います。

相補な合成オリゴDNAを合成して、アニーリングさせて二本鎖にさせるときも同じようにやります。より慎重にアニールさせる場合や、もっと長いDNA同士をアニールさせる場合は、#1さんの書いているような方法でゆっくり冷ますようにします。

ただし、オリゴDNAは長いDNAよりもアニーリングの速度が非常に速いこと（たとえばサザンハイブリで、一般的な鎖長のプローブでハイブリすると、プラトーに達するまで一晩くらいかかるけれど、オリゴプローブだと30分くらいだとか、理論式などはMolecular Cloningなどを参照）、それと、おそらく過剰量のBiotinylated-Oligoプローブを入れる（PCRでプライマーをアニーリングするようなものですね）でしょうから、あんまり丁寧にやらなくても十分いくでしょう。

お礼

いけそうですね。少し安心しました。
ちなみに、プローブにアニリングされたものを単離する時はまさにNO.3のリンクにあるストレプトアビジン-パラマグネティックビーズを使おうと思ってました。うまくいかない場合は、リンクのキットを試してみようと思います。ありがとうございました。

回答No.3

geneticist12

思い出したのですが、InvitrogenのGene Trapperというキットで同じようなことをします。これは、酵素で一本鎖にしたcDNAライブラリーにビオチン化したオリゴDNAプローブをハイブリさせて、目的のものを単離するという方法です。これでは、添付のハイブリバッファー（組成不明）中で、37℃、1時間のインキュベーションでハイブリさせています。
添付説明書が下記のURLからダウンロードできます。参考になりましたら。

参考URL：

http://www.invitrogen.co.jp/catalogue/invitrogen/10356-020_001.shtml

回答No.1

Chicago243

なんともいえませんね。その手の方法は確かにありますが。条件については詳しくは調べないと分かりません。標準的な条件はあると思いますがそれでも幾らか条件をふる必要はあると思います。ポジコンを作ってそのライブラリーに、実際にあり得る濃度加えて見るとかして条件を見つけるのがいいと思います。
室温に戻す時、ゆっくりと戻すとミスアニーリングがの可能せいを減らすことができるみたいなので、徐々にひやすプロトコールを使うことが多いようです。

厳密にやるのがいいと思いますが、1Lの90度ぐらいのお湯にチューブを浮かせといて、室温で放置してゆっくり冷やすとか、ヒートブロックを95度にセットしてスイッチを切って温度が下がるのをまつというのも手だと思います。

お礼

ありがとうございます。条件さえ整えればできそうですね。
条件については、アニリングのときは物質量よりも測定しにくいMOL濃度の方が影響しそうなので、確かに条件をふってやって確認した方がいいですね。
ゆっくり冷やす方法も参考になりました。