プライマーの除去

質問

PCR産物のプライマーを除去したい場合キットを使うしかないのでしょうか。
エタ沈である程度除去できるのでしょうか。
マニュアルの方法を知っている方教えていただけないでしょうか。
ハイスループットなのでゲル切り出し以外の方法を知っている方お願いいたします。

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

わたしが良くやるのは
Microspin (Amersham)ゲルろ過スピンカラム
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=542&goods_name=MicroSpin+Columns+%3C%21%2D%2D+2+%2D%2D%3E
Qiaquick (Qiagen)イオン交換スピンカラム
http://www1.qiagen.com/Products/DnaCleanup/PcrCleanup.aspx
です。
ゲルろ過のほうが、washが必要ないだけ手間がかかりません。
一検体あたり100から150円というところでしょうか。

同僚で、PEG/NaCl沈殿でプライマー除去して、Seqしているひとがいます。
プラスミド精製のとき、RNAを上清中に除去する方法の応用です。
エタ沈では、プライマーもかなり沈殿してしまいます。

ExoSAP-ITという試薬を利用する手もあります。
http://www.jp.amershambiosciences.com/catalog/web_catalog.asp?frame5_Value=574
PCR産物中のプライマーをExoIIIで分解し、
フリーのヌクレオチドをシュリンプアルフォスで脱リン酸し、
そのままSeqに持っていけるというものです。
楽ですけど、コストは上記のカラムなみです。

補足

ご回答を元に調べてみたのですが、
PEG沈は有効なようですね。
PEG6000+NaClでよろしいでしょうか？
また濃度はどれくらいが目安でしょうか？

ExoSAPは便利なのですが、
シークエンスの精度が落ちるようなのでこれまで使っていませんでした。
最近ampureという製品が出たそうなので、
少し興味を持っています。
最初の設備投資が高いようなので迷ってしまいますが。。。

回答No.3

geneticist12

>PEG6000+NaClでよろしいでしょうか？
>また濃度はどれくらいが目安でしょうか？

手元のプロトコールでは
PEG8000（6000でも可）
0.6 vol.の20% PEG/2.5M NaCl（常備ストック溶液の40% PEGと5 M NaClを1:1でまぜる）を加え混合、0-4 Cで30分以上静置、Max speed, 4 Cで10分遠心、沈殿を70% EtOHでリンスです。

回答No.2

TCA

ハイスループットということですので、ゲル濾過カラムの96穴プレートタイプのものをご紹介します。

参考URL：

http://www.clontech.co.jp/product/catalog/008002002.shtml

お礼

ありがとうございます。
ゲル濾過も検討したいと思います。