ラベリング

質問

ノーザンやサザンを行うときにつかうProbeの作成方法について教えてください。
現在私はランダムプライマーを用いたラベリングをしています。TakaraのBcaBestrabelingkitです。
最近PCRプロダクトをProbeとすることが多くなってふと思ったのですが、こんなキットを使わなくともPCRにもちいたPrimerと適当なポリメラーゼを用いもラベリングができるのではないかと・・・。
TakaraのキットはランダムプライマーとKlenowフラグメントが入っていて、55℃でランダムプライマーのアニーリングとKlenowによる伸張を同時にやっているようです。
そこで、私はPCRプロダクトとラベルとTaqとｄNTPｓ混ぜた後に、ボイルし、プライマーのアニーリング温度まで下げ、最後に72℃にすればラベルができるのではないかと考えています。

この考え方は間違っていますか？
また、Kitを使わずにラベリングする方法をご存じの方、やったことがある方は教えて頂けませんでしょうか？

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

PCRを利用して、インプットしたテンプレートDNAよりも大量のプローブのアウトプットを得るという方法もありますから、原理的には可能です。しかし、考慮すべき点がいくつかあります。

1．ランダムプライマーだと、出来上がったプローブは数百bpに断片化しています。PCRプライマーのように末端のプライマーだけだと、テンプレートの長さに応じた長さのプライマーができます。プローブの長さは、ハイブリのカイネティクス（Cot）に影響します。すなわち、一本の長いプライマーより断片化したプライマーのほうが早くハイブリを完了します。また、一本の長いプローブのなかにプローブとして機能しない配列が含まれると（ノーザンのときイントロンを含むプローブなど）、ハイブリの安定性が下がる可能性があります。

2．Klenowは低い基質濃度（dNTP濃度）でも高い伸長性があるのに対し、Taqは基質濃度の低下にセンシティブです。一般的にklenowなどでRIラベルする場合、ラベルの入ったヌクレオチド（たとえばdCTP）はRIの使用を必要最小限にするため濃度が低くなりますが、この条件ではTaqには十分な伸長性がありません。またnon-RIラベルの場合、ラベルされたヌクレオチド（たとえばdUTP)はTaqの基質になりにくいので伸長性がかなり落ちます。いずれにしてもラベルの入っていないヌクレオチドを加え、基質濃度をあげてやる必要があります。これは、比活性を下げることにもなります。

ランダムプライマーと酵素（Klenow）を買えば、キットを使わず、ランダムプライムラベルをすることは可能です。ランダムプライマーは結構安い試薬です。もっと安く上げようとしたら、胸腺DNAやSperm DNAをDNaseなどで細かく分解したものをプライマーにするという方法もありますが（昔々は、そういう方法も使われていました）。

回答No.2

geneticist12

BcaBestは、TAKARAが自社開発した耐熱性DNA polymeraseで、Klenowとは違います。Klwnowなら、55℃では失活してしまいますね。