DNAに関する実験技術に際して質問なんですが

質問

今実験をしていてよくわからないことがあるので回答いただけますと助かります。

質問内容は以下の点です。

(1)ゲノミックサザンハイブリダイゼーションを行い、検出はRIラベルしたプローブ（PCRで増幅した鋳型DNAをプローブに利用しています）で処理を行ったのですが、検出器にかけてみると、バンドがスメアになりすぎており目的の位置にバンドがあるのかどうか確認することができません。
これは何が原因でしょうか？
ちなみにラベリングする際に使用している試薬は、TOYOBOのBca Labering kitを利用しています。

(2)マウスの胎生7.5日目の胚を利用して、ゲノミックタイピングを行いたいのですが、4％PFAで固定処理を行ったサンプルからDNAは抽出できるものなんでしょうか？

教えていただけますとありがたいです。

回答No.1

Mr_Spock · ベストアンサー

ゲノムDNAは高分子で、均質に溶けにくしばしば塊が残っていたり、きれいに溶けても粘性が高いです。そのため制限酵素が均質に働きにくくて切れ残りが出やすいです。
1) ゲノムDNAの沈殿を臍溶解するときは時間をかけてよく溶かす（たとえば一晩以上）。
2) 濃度を低めにする（たとえば100 ng/uL程度）。同じDNA量なら体積を増やし低濃度で消化した方が問題が起こりにくい。エタノール沈殿してから、ロードする体積に溶かし直す。
3) DNA量をできる限り少なくする。多いと切れ残りが出やすいし、オーバーロードになって泳動の分離も悪くなります。ゲル/ウェルのサイズにもよりますが、サザンのシステムに不備がなければ、ほ乳類ゲノムでも1 ug/laneくらからシングルコピーが検出できるはずです。
4)制限酵素消化時間を長めにしたり酵素量を多めにする。粘性が高く酵素のアクセスの自由度が制限されるので、通常言われているような1 ug DNA 1U制限酵素、1時間消化では足りません。
5) 制限処理の途中で何度かかき混ぜる（消化が進んで粘性が下がり溶けやすくなったところでさらに均質化を図る）。また、途中で制限酵素を足す。6)ゲルに乗せてから、しばらく時間を置いて（たとえば30分）泳動をはじめる。サンプル中で部分的に濃度・粘性が高い部分があるとオーバーロードになるので、時間を置くことでDNAをウェルのなかで拡散させ均質化を図る。

また、PCRでは非特異的産物や伸長しきらない短い鎖が混入していることがあり、こういうのがラベルされるとプローブの特異性が低くなって、ノイズを生じます。特にPCR反応中にラベルを入れる方法だとこの危険性が高いです。もしそうなら、無標識でPCR→産物の精製→ランダムプライム法で標識するのが安全です。

>、4％PFAで固定処理を行ったサンプルからDNAは抽出できるものなんでしょうか？

PCRを目的とするDNAやRNAを固定サンプルから抽出することはよく行われています。ゲノムサザンにはいろいろな意味で難しいでしょう。