ターゲティングベクターについて

質問

ノックアウトマウスの、ターゲティングベクターを作る際に、
片方の相同領域を短くする理由は何ですか？
またネオマイシン耐性遺伝子の向きが正方向で作成したもの、逆方向で作成したものがあるのですがこれはどうしてですか？教えてください。よろしくお願いします。

回答No.2

geneticist12

相同領域を非対称にするのは、経験的にそのほうが相同組み換えが起こりやすいからだと聞きました。この手の手法は試行錯誤と経験の積み重ねで育て上げられてきたところが多くて、理屈はわからないけど、、、という「常識」も少なくないようです。

回答No.1

MIYD

両方とも長いとランダムインテグレーションされた時に
サザンやPCRでチェックがしにくいために片方短くする方法があります。
(ターゲッティングコンストラクト内と、その外にプライマーを設計したPCR、
　または中と外の制限酵素サイトでサザンを行う必要があるため)

正方向でプロモーター無しで薬剤耐性遺伝子を入れておくと、エンドのプロモーターが必要になるので、
ランダムインテグレーションで入ったときに発現する確率が低くなり、
薬剤耐性クローンがホモロガスリコンビネーションしている可能性が高くなります。

向きに関係なくプロモーター＋薬剤耐性遺伝子で作ると、
薬剤耐性遺伝子の発現量が高くなるので、
エンドのプロモーター活性の低い遺伝子でも薬剤耐性クローンが得られることができます。

薬剤耐性遺伝子の配列(向き)によってターゲティングコンストラクトの立体構造が変わり、
ホモロガスリコンビネーションの効率が変わる可能性があるために、
プロモーター＋薬剤耐性遺伝子を両方の向きで作っていれてみる方法があります。