サザンブロット解析について

質問

遺伝子導入マウスの作成を考えターゲティングコンストラクトを構築中です。サザンブロットでDNAを検出したいと思っています。プローブを相同領域の外側にとれるように、と実験書には書いてありますが、実際どのように作成すればいいのでしょうか？具体的にはあるDNAをマウス染色体上のRosa26 locusにノックインしたいと思っています。またアイソトープラベルは必ずしも必要でしょうか？もし必要ならどのようにすればようのでしょう？すみませんが、よろしくお願いします。

回答No.2

Amakosan

説明足りず申しわけありません。
SAH、LAHというのは、組替の際にinsertの前後に付ける相同領域の短腕、長腕のことで、short arm of homology、long arm of homologyのことです。
プローブの設定については、200-2000bpほどの特異性が高い配列を選択します。
・プローブを作製する予定のゲノム領域にprimer3（http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi）でプライマ設計
↓
・blast（http://blast.ddbj.nig.ac.jp/top-j.html）でアラインメント検索し、特異性を確認
といった流れです。

お礼

なるほど。分かりやすい説明、ありがとうございました。

回答No.1

Amakosan

・ゲノムを制限酵素処理した際に野生型と相同組替クローンで検出部位の断片サイズが異なる酵素を選択
・プローブは制限部位～SAH又は制限部位～LAHの間に設定
・プローブのラベルには必ずしもRIは必要ではない

参考URLに私が使っていたnon-RIキットのカタログを貼ってあります。
個人的にはRIラベルの方が好みなのですが、時流はnon-RIらしい・・

参考URL：

http://www.roche-biochem.jp/catalog/index.php/product_3.6.12.1.9.1/category_32996.html

補足

回答ありがとうございます。プローブの設定部位は分かるのですが、DNA断片はどのように取ってきたらいいのでしょうか？あとSAH、LAHとは何の略語でしょうか？なにぶん、初心者ですみません。