アダプターライゲーション？について

質問

全長約６kbのベクターをEcoRI/XbaIで切断し、そこに大体55kbのアダプターをライゲーションしようと試みているのですが、なかなか成功しません。大腸菌のコロニーが生えてこないのです。ベクターのみのトランスフォーメーションでは、コロニーは生えてきませんでしたし、アダプター生成時のアニーリングがまずかったのか、他に原因があるのか分かりかねています。
ベクターはアルフォス処理はしておらず、インサート、つまりアダプターの方にはリン酸基が付加されていないので、理論上繋がることはつながるはずなのですが。
何か解決策が内ものでしょうか？

回答No.2

desert · ベストアンサー

もし私がやるとすれば、

(1)ベクターをBAP処理、インサートをリン酸化。
（ベクターが長い程、ベクター同士の分子間反応が起こりやすくなるので、それを防ぐために、ベクターの方を脱リン酸化しておく）
(2)ベクター、インサート共に濃度を落として（ベクター２～３kbpにインサート１kbpを入れる反応と比べて濃度を落とす）、ライゲーションさせる。
（ベクターの一端とインサートの一端がライゲーションされた後で残った末端同士が着く前に、他のベクターやインサートと出会いにくくするため）
(3)ライゲーション反応液を５～１０本位に小分けして、それぞれで出来るだけ新鮮なコンピテントセルを形質転換。
（もともと６kbpのベクターは非常に入りにくいので、形質転換効率を少しでも上げるため）
(1)～(3)で目的の形質転換体が得られる可能性が多少は増えます。
ただ、おそらく上記の方法でも一度ではうまく行かないと思いますので、何度かやってみます。
それでもうまく行かなければ、ベクターを真ん中あたりで切るような制限酵素処理をしてベクターＡ部、Ｂ部に分けて、インサートとＡ部のライゲーション、電気泳動してゲルからの精製（ここではライゲーションに使われなかったインサートが除かれるだけですが）をして、それをＢ部とライゲーション、形質転換する。

という感じでやってみると思います。
あくまで私がやるとすればのお話です。
参考になればよいのですが。

お礼

様々なご助言、ありがとうございました。desertさんが挙げて下さった可能性を考慮して、再度実験を行ってみます。(1)の方法は考えてみたのですが、(2)(3)の方法については思いもよりませんでした。是非、参考にさせて頂きます！

回答No.3

geneticist12

手順自体はセオリー通りだと思います。つまり、
アダプターの分子数をベクターに比べて大過剰にすることによって、ベクターのセルフライゲーションを防ぎ、アダプターーベクターのライゲーション頻度を高める。ただし、アダプターはそれら同士の重合を防ぐために、リン酸化を行わない、ということですね。

アダプターライゲーションは、反応としては非常に容易なものだと思います。むしろ、形質転換のステップを疑いますが。おなじシステムで6-kbかそれ以上のプラスミドで形質転換はうまくいっていますか？

ほかに考えられる原因はやはり、うまくアニーリングしたアダプターが極端に少ないとか、アダプターに質的問題があるのか。。。原理的にアダプターを増やすことで、ライゲーションの効率は上がりますから、思い切ってアダプターを大量に加えることで、多少の質的問題はクリアできるかもしれません。

お礼

geneticist12さんには、コンピテントセル作製の際にも質問に答えて頂き、ありがとうございました。この時作製したコンピテントセルを用いて、形質転換を行いました。コンピテントセルの転換効率はおよそ10^7程度で、実験に耐えうると判断しました。
同じシステム系で、同じベクターに5kbのインサートをライゲーションしましたが、この時はコロニーが生えてきました。もしかしたら、コンピテントセルが駄目になりつつあるのかもしれません。アダプターはカスタムオリゴ合成で注文したものですが、グレードが一番低いものなので、アダプターの質的問題は考えられることです。（恥ずかしながら、当研究室、ただいま資金不足でして、あまり高価な代物を購入することができません。）
ご指摘頂いた可能性をもとに、原因を熟考してみます。

回答No.1

blackdragon

ベクターはどういった種類ですか？
形質転換法はどういう方法ですか？

55kbもあったら、普通のプラスミドでは、保持すること自体難しいと思いますよ。
また、形質転換も、塩化カルシウム法では無理でしょう。

補足

ごめんなさい！アダプターは55bpです。間違って書いてしまいました。ベクターはpact5Cというもので、細胞で発現させるベクターの１種です。トランスフォーメーションは、通常のプロとコールに従い、コンピテントセルにプラスミドDNAを添加して、ヒートショックを与えて、というものです。