大腸菌の形質転換について質問です。

質問

大腸菌の形質転換について質問です。
X-GalとIPTGと形質転換した大腸菌をまいたところ、青コロニーが全く出ませんでした。
この原因は何が考えられるのでしょうか？
自分の中で一つ気になるのは、PUC19ベクターを使ったのですが、ベクターを調整した後電気泳動でベクターを確認したところかなり薄かったことです。
もし、ライゲーションした時にベクターが全く入っていなかった状態だと、コロニーはどのようなものが現れるのでしょうか？
何かわからないことがあれば、補足させていただきますので、質問の回答よろしくお願いします。

回答No.4

sakasagitsunen · ベストアンサー

kakakakaka 10 さん　こんにちは

以下の質問にお答えいたします。

＞X-GalとIPTGと形質転換した大腸菌をまいたところ、青コロニーが全く出ませんでした。

（a）白いコロニーばかりだった場合

★　一見すると、目的の遺伝子断片が効率良く取り込まれたように見えますが、遺伝子断片の短い目的外の遺伝子断片（プライマーダイマーのような「いわゆる、クズ断片」が積極的に取り込まれた可能性があります。ご存知のように、遺伝子断片が短いほど、ベクターに取り込まれやすいので。

☆　これを回避するには、インサートの際に用いる目的遺伝子断片から目的外の遺伝子断片を取り除く精製キット（アガロースゲルで電気泳動し、目的のバンドを切り出し、バンドから目的遺伝子断片を抽出するキット）で精製し、塩基数を整えた後、インサートに望みましょう。

（b）白いコロニーも青いコロニーもなかった場合

★　コンピテントセルが悪くなっており、ベクターが取り込まれなかった可能性があります。

☆　市販のコンピテントセルならば、新しい物を使い、コンピテントセルを自分で作っているならば、コンピテントセルを作る段階で、最後に一気に大腸菌を増やす段階の温度を低温（25度）でゆっくりと作れば、コロニーを沢山作る質の良いコンピテントセルが出来上がります。時間がかかりますが、がんばってください！

＞自分の中で一つ気になるのは、PUC19ベクターを使ったのですが、ベクターを調整した後電気泳動でベクターを確認したところかなり薄かったことです。ライゲーションした時にベクターが全く入っていなかった状態だと、コロニーはどのようなものが現れるのでしょうか？

★　ご存知のように、PUC19ベクターにはアンピシリン耐性遺伝子が含まれております。そのため、コンピテントセルをまく寒天培地にはアンピシリンを入れなければなりません。この条件下で、ライゲーションした時にベクターが全く入っていなかった状態であると、PUC19ベクターが取り込まれていない大腸菌はアンピシリン耐性がないので、コロニーが出来ないことになります。

☆　アンピシリン入りの培地にコンピテントセルをまきましょう！

★　最終段階でベクターを確認した際、十分な大腸菌の沈殿を1.5mLチューブ上で確認出来たのに、アガロースゲル上でベクター付近のバンドが薄かった場合、大腸菌中にもともとPUC19ベクターが少なかった。つまり、アンピシリン入りの寒天培地を使用していなかった可能性があります。アンピシリン入りの寒天培地を使っていた場合、少々複雑な話ですが（その場にいないと分かりませんが）、最終段階でベクターをブタノールかエタノールで沈殿させてて、乾燥させて、TEバッファーか何かでベクターを溶解させる際に、十分にタッピングせずにチューブの上の方までついた目に見えない沈殿物（ベクターの沈殿の場合、よくあります。）を回収しなかった可能性があります。

☆　ベクターをアルコール沈殿させて、乾燥させた後、TEバッファーに再び溶かす際には、TEバッファーがチューブ内にまんべんなくいきわたるように、しつこくタッピングをしましょう！

検討を祈ります。ガンバ！

回答No.3

otx

私の前の回答で意図していたことは、

もともとやっている実験の意味、目的は何か？ってことを確認する必要がある、ということ、と、
どのような原理で行なっている実験かということを確認する必要がある、ということです。

付け加える形でNo2様が書いていらっしゃいますが、
No2様の回答内容は、私の意図と別の意図で書かれたもので関連性はありません。

No2様のは、実験の意味、目的、そして原理を既に知っている人が
知っているにもかかわらず、それに合致しないような大腸菌を使ってはいないか？
今行なっている実験の個別な問題点を知るための情報を提供してほしい、ということを
意図しているものです。

その辺が全く違うので。

確認のために。

回答No.2

negigi

#1の方に追加で、以下も補足してください

4. 使った大腸菌株

5. ライゲーションの際、使った制限酵素の種類とインサートの由来、長さ

よろしくお願いします

回答No.1

otx

その前に、確認をして下さい。

１、そもそもX-GalとIPTGを使って大腸菌をまくということは
　　何を目的としてやっているのか？

２、プレートに抗生物質を加えていませんでしたか？（加えていると思います）
　　その目的は何であるのか？

３、＞PUC19ベクターを使ったのですが、ベクターを調整した後電気泳動でベクターを確認したところかなり薄かったことです。

何を基準に「薄かった」と言っているのでしょうか？