western blotにおける、抗体のストリッピングの原理について

質問

タイトルの通りです。
メンブレンから抗体を除去する原理についてですが、
成書を調べても載っていません。
どなたか宜しければ教えてください。

回答No.1

TCA · ベストアンサー

抗体の除去は、抗原認識できないように免疫グロブリンの構造を変え、抗原との結合をはずすことによります。よく使われるのは、HClなどpHによって立体構造を変化させたり、DTTなどの還元剤によるL鎖とH鎖をつなぐジスルフィド結合の切断、グアニジン塩酸塩などの変性剤による変性です。

お礼

お返事ありがとう御座いました。
私は今免染をしているのですが、非特異を抑えるのに苦労しています。
そこで,westernで用いるリプローブの方法を使えば、これらを除去できるのではないの？原理的には同じだし？でも理論は？と考え質問した次第です。
今現在塩酸を使って試しています。ありがとう御座いました。

回答No.4

geneticist12

抗体を抗原にたいするアフィニティー精製して溶出するときの方法が参考になるかもしれません。glycine bufferで酸性（pH 2）、エタノールアミンでアルカリ性の溶出が良く使われていると思います。詳しくは、成書をご覧ください。

でも、非特異的反応を抑えるのはスタンダードな方法をまず試したほうが良いのでは？たとえば、
・抗体をアフィニティー精製する
・抗体をサンプル（アセトン粉末にしてなど）に対して吸収して使う。簡便には、一度使った抗体の希釈液を回収して何度も使うといいです。非特異的抗体が吸収されて特異性があがります。免疫抗原に対する抗体は量が多いので、数回の吸収くらいではまずなくなりません。
・抗体の希釈率を上げる。それでシグナルが弱くなるようだったら反応時間をのばす。
これはまさに、
>非特異結合が優先的に外され、目的の陽性反応のみが強調されるだろうと考えたんです。
を利用したほうほうです。特異的反応は結合係数が高いので濃度が低くても成立しますが、非特異的反応は一般的に結合係数が低いので、濃度が下がると抗体抗原複合体の状態を保てなくなり、急激に反応性が落ちます。

お礼

お返事有難う御座います免染に際しては、スタンダードな方法はあらかた試してみました。
　●抗体の再使用は、確かに簡単な精製法ですね。抗体がもったいないので再使用したりしてましたが、成る程ー。次回その様に考えて試してみます。同一動物の血清を一次抗体に混ぜて放置後に使用、という、似たような事は試したんですが、示唆して頂いた事は思いつきませんでした。
　●抗体の希釈、反応温度、時間等は色々振ってみました。ポリクロの抗体なので、非特異はしょうがないのかなと諦め始め、別の抗体を探している所だったのですが、もうちょっと粘ってみます。

補足

先日は回答有難う御座いました。
　その後色々考えまして、ブロッキングの血清の代わりに、胎児を丸ごとホモジナイズした上澄みを一次抗体に加え、1時間ほど放置したものを用いて抗体反応を行った所、きれいにバックがなくなりました。
　この度はご丁寧に有難う御座いました。

回答No.3

TCA

下記サイトにてWestern blottingのトラブルシューティングをダウンロードできます。非特異的反応を抑える方法も複数あります。ご参考になりましたら幸いです。
http://www.jp.amershambiosciences.com/technologies/ecl/index.asp

抗原を動物に免役した時には、抗原に対し異なる結合をする様々な抗体が作られます。このようなポリクローナル抗血清を使用した時に、その中の一つがたまたま別のタンパク質と強く結合する事もあります。

お礼

有難うございます。参考になります。
　私今まで免染ばかりしてきており、最近生化学的な実験をし始めたのですが、それらの手技が応用できないかな、と考えている所なのです。

補足

先日は回答有難う御座いました。
　その後色々考えまして、ブロッキングの血清の代わりに、胎児を丸ごとホモジナイズした上澄みを一次抗体に加え、1時間ほど放置したものを用いて抗体反応を行った所、きれいにバックがなくなりました。
　この度はご丁寧に有難う御座いました。

回答No.2

TCA

抗体の非特異的反応を抑制するのと、抗体のストリッピングでは原理が全く違います。非特異的結合を抑制するために抗体の立体構造を変えてしまっては、本来反応するべきものにも反応しなくなります。界面活性剤の種類やブロッキング剤を検討して抗体反応液の組成をかえたり、反応温度や時間をかえたりすると、非特異的結合や吸着が抑えられることがあります。
アフィニティー精製を行って、より特異的な結合をする抗体を得るという手もあります。あるタンパク質の部分ペプチドを抗原に抗血清をつくった事があるのですが、最後に大腸菌につくらせた全長タンパク質でアフィニティー精製をして特異性の高い抗体が得られた経験があります。

お礼

お返事有難う御座います。
＞非特異的結合を抑制するために抗体の立体構造を変えてしまっては、本来反応するべきものにも反応しなくなります。
↑いや、そういう意味では無いです。
反応を終えた切片上の非特異反応を除去するために、ストリッピングをしようと思ったのです。
多分非特異結合は、目的の検出したい結合よりも緩い、と考えられるので、ストリッピングを行えば、非特異結合が優先的に外され、目的の陽性反応のみが強調されるだろうと考えたんです。
　でも塩酸によるストリッピングは駄目そうでした。やっぱり無理かもしれません。