ウエスタンブロットについて

質問

質問させてくださぃ！！

ウエスタンブロットの
ブロッキング→１次抗体をつける→２次抗体をつける
という流れを詳しく教えてほしいです。
ブロッキングはスキムミルクをT－TBSに溶かしたものをタッパーに入れて揺らしたらいいんでしょうか？？
１次抗体はラップを引いてその上に１次抗体とキャンデットシグナルをたらしメンブレンをつけるので合ってますか？？
２次抗体はどのようにつけるのでしょうか？？

間に挟むWASHについても教えてほしいです。

よろしくお願いします！！！

回答No.1

r_celery · ベストアンサー

ブロッキングは5%スキムミルクや5%BSAが一般的かと思いますが、抗体によります。抗体の説明書に何か書いてあればそれに従ってください。リン酸化抗体などの場合はスキムミルクは避けた方がいい場合もあります。
T-TBSはTBS＋Tween20のことでしょうか。ブロッキングはその方法でOKです。
「キャンデットシグナル」というのは聞いたことがないのですが増幅剤か何かですか？ 1次抗体も2次抗体も、ブロッキングと同じようにタッパーか何かに入れて揺すればよいです。ただ、その場合必要な抗体溶液が多くなってしまいますので、減らしたければハイブリバッグなどを使うといいでしょう。ラップに付けただけだと抗体の反応ムラが出るかもしれません。
抗体反応後の洗浄はタッパーに入れて揺すりながらT-TBSで5分x3回くらい行ってください。

回答No.2

Dr_Hyper

要点のみですが、
一次抗体二次抗体ともメンブレンが乾いてはいけませんので、ラップでもナイロンバックでもいいですが抗体溶液が蒸発しないように、またメンブレンが乾燥しないように注意してください。Can get signalは一次抗体用と二次抗体用がありますから注意して。washは一次抗体、二次抗体ともに通常３回程度行います。最初に何度かすすぐ形で洗浄し、そのあと１０分程度二回洗う方法でも構いません。