ウェスタンブロットについて トラブル

質問

ここ２ヶ月ほどウェスタンブロッティングしたおります。しかし、現像してもバンドが5回に1回にポジコンマでもが全く検出できなくなります。ミルクは５％スキムミルク、０．１％牛アルブミン、PBS-TでｐH７．４にし、一次抗体、２次抗体の濃度は間違っておらず、最後のECLの濃度も間違っていません。メンブレンにちゃんと転写されているかの確認（ポンソー染色にて）行ったところちゃんと転写されていました。原因が分からず本当に困っております。どなたか分かられる方教えてください

回答No.1

noname#19193 · ベストアンサー

抗体はコマーシャルサイトの抗体を使用されていますでしょうか？　それとも研究室の？
ウェスタンは条件の違いで検出状況が左右されることがありますよ。
ポジコンがあるのでしたら、それがまずきちんと確実に検出される条件（濃度はゆうに及ばず、１次抗体反応時間、洗浄時間、２次抗体反応時間、洗浄時間）をきちんと決定しましょう。ご存知の通り、抗体によってきれいにバンドがでる条件が違います。いままで検出できたポジコンが検出できなくなるのでしたら、なんらかの条件の違いがあると思っていただいてよいかと。PBSを作り変えたとか、スキンミルクの成分が変わったとか、２次抗体を間違えているとか（ウサギとマウスを間違えたなど）。試薬は自分専用ですか？それとも誰かと共有していますか？
もう一度実験ノートを見直し、同じ研究室でウェスタンをよくやっている人に相談してみてはいかがでしょう。

補足

そうですね、一つ一つ確かめていこうと思います。いつかはでると思います。本当にありがとうございました。