制限酵素サイトが目的遺伝子内に存在していた…

質問

EcoR1の制限酵素サイトを含むプライマーと他のの制限酵素サイトを含むプライマーを設計して、目的の遺伝子（約2000bp）をPCRで増幅させました。
しかし、いざEcoR1でのファストダイジェストをしアガロース電気泳動をすると、目的の位置ではなく約1000bpのところにバンドが現れました。
遺伝子のデータベースで確認したところ、目的遺伝子の配列中にEcoR1サイトと全く同じ塩基配列があることに気付きました。
泳動結果と照合して、おそらくその位置でEcoR1により切断されたのだと思われます。

私の不確認が原因だとわかっていて、すごく後悔しています。
この場合、EcoR1のサイトを含まないプライマーを設計しなおすのが妥当であると考えられますが、
もしも、なんとかこのEcoR1の制限酵素サイトを含むプライマーを用いてPCRをした断片を目的の位置で制限酵素処理できる方法がもしもありましたら、教えていただけませんか。
どなたか打開策をご存じな方がいらっしゃいましたら、わかりやすく教えてください。

また、このことを相談したところ「EcoR1（NEB社）がAのオーバーハングしているか、Aの付加反応があるか」を調べてみることになりました。
この件を調べることで、何か改善できる点があるのか、自分なりに調べましたが答えが見つかりません。
恥ずかしながら知識不足のゆえ、わかりやすく解説していただけ方がいらっしゃると幸いです。
また、その調べ方だけでもご存知の方がいらっしゃいましたら、自分の勉強のためになりますので調べ方(本等でもかまいません)を紹介していただけませんか？
長文になりましたが、ぜひともよろしくお願いいたします。

回答No.3

tnlu

2断片のライゲーションを試みるのはどうでしょう？
泳動ででた1kbのバンドには両末端がEcoRIのもの（断片A）と、片方がEcoRIでもう片方が異なる制限酵素サイトのもの（断片B）が含まれていますよね。
それを混ざったまま切り出し精製して、そのままベクターとライゲーション、トランスフォームします。
大方断片Bのみのコロニーでしょうが、効率と運がよければ、ABがちゃんとした向きで入っているものも得られる可能性があります。（Aが逆になっている可能性ももちろんあります）

プライマーを再設計するのが一番確実だとは思いますが、この方法でも意外と入りますよ。

お礼

なるほど！運がよければ可能性はあるのですね！
一案として検討していきたいと思います。
回答していただき、ありがとうございました!!

回答No.2

guragura77

#1 です。
うっかり間違えていたので訂正します。バイオ実験イラストレイテッドは秀潤社でした。

ちゃんと確認しないと痛い目を見るぞ、と回答でオチを付けた格好になってしまいました。
不注意でまたミスをしないようにお互い気をつけましょうね。

お礼

ご丁寧にありがとうございました!!
書籍も参考にして検討していきます。
ミスもしないように注意して、頑張りたいと思います!

回答No.1

guragura77

まず一言。たぶん EcoRI をどうにかして使おうとするよりは、プライマーを作り直した方が時間もお金も節約できると思いますよ。

後半の話についてですが、指示されたことがわからないなら、まずは指示した人に尋ねて下さい。
うろ覚えの人間が他所で質問するより、よほど正確な情報が得られるはずです。

＞EcoRI（NEB社）がAのオーバーハングしているか、Aの付加反応があるか

これはたぶん聞き違えてます。
と言うか、EcoRI は G|AATTC という具合に切るものと決まってるんですから、今更調べるようなことではありません。
おそらく PCR に使った酵素に TdT 活性があるかどうかを聞かれたのではありませんか？
TA クローニングが出来るかどうかを検討しているのだと思います。

「TdT 活性」も「 TA クローニング」も普通に検索すればすぐ情報が見つかりますので調べてみて下さい。
あるいは、羊土社のバイオ実験イラストレテイテッドあたりを読んでみるとか。
使用した酵素に TdT 活性があるかどうかは、その酵素の説明書かカタログ等を見れば書いてあるはずです。

仮に TA クローニングをするのだとしても、T ベクターを作るところからやるのであれば、それなりにお金も時間もかかります。

お礼

早々に回答してくださり、ありがとうございます!!
私の至らない点・勉強不足の点を含め、よく確認のうえ今後の方針を相談してみようと思います。

「PCR酵素にTdT活性があるか」と聞き間違えていますね…ご指摘ありがとうございます。
早速説明書で確認してみたのですが、どうもTdT活性はなさそうです。
やはり新しく、EcoR1サイトを含まないプライマーを設計するほうが良さそうです。

わかりやすい丁寧な解説をしてくださり、本当にありがとうございました!!