制限酵素処理

質問

題名の如くなのですが、複数ある同じ制限酵素サイトの中で、特定のサイトだけを切断したい時、どうすればいいでしょうか。
例えば、ベクターにあるインサートが入っていて、その両末端がEcoRIでライゲースされている場合、このうち５’末端のみのEcoRIサイトを制限酵素で切断したいとしたら、どういう方法が考えられるでしょうか？
これを通常の方法で制限酵素処理してしまうと、インサートがベクターから抜け出てしまうので、どうすべきか困っています。
何かコツをご存じの方がいらっしゃいましたら、ご伝授ください。

回答No.3

takumicchi · ベストアンサー

タグ配列をつける場合普通はパーシャリーダイジェストはしません。タグの種類によりますが、PCRで挿入したい断片を作って、その部分だけを入れます。

今回の場合N末側につける場合

　　　　A 　 　 EcoRI　 　B　　　　　　 　 EcoRI
１．---|--------|======|===insert======|--------

　　　　A　　 　 　 　B
２．---|*****=====|

１のようになっていてMSCの外側の制限酵素Aとインサート側のBを使います。これはユニークでなければなりません。

２番のような断片を増やし切り貼りでOKです。

上記のような方法が使えない場合は、タグ配列をもつプライマーでInverse PCRでを行って、セルフライゲーションさせます。

もしくはインサートを別の制限酵素を導入するようにPCRして別のタグの入るベクターに入れなおすか。

いずれにせよパーシャリーはあまり考えられません。

お礼

なるほど、partial digestionはタグ配列を付加する時には、あまり用いない方法なんですね。説明頂いたPCRを用いた方法の方が確かに簡単だし、時間もそれほどかからないですね。それぞれ制限酵素AとBのサイトを探して、ユニークなサイトがあれば是非試してみたいと思います。
ためになる回答、ありがとうございました。

回答No.2

MIYD

partial digestionですね。
制限酵素を薄く短時間処理することによって完全分解していない産物を得ます。

1分から5分間、制限酵素処理をしてEDTAなどで反応を止めます。
EcoRIだともっと短時間のほうがいいかもしれません。
条件検討用にチューブを複数用意して、時間ごとにEDTAをいれて止めて、泳動してみて,ちょうどいい時間を探すのがいいと思います。

でもこの場合はどちらのEcoRIサイトが切れても同じ長さの直鎖状DNAになるので、
ゲルから切り出しした後に何か処理(tagか何かをつける？)した後で、
どちらに入ったか制限酵素マップやPCRなどで調べることになると思います。

参考URL：

http://bekkoame.okwave.jp/kotaeru.php3?q=1482898

お礼

やっぱり、partial digestionですよね。
一番最初に思い付いたのですが、今まで経験がないので、どうやろうか迷っていました。アドバイスをご参考に、トライしてみます。
ご丁寧なアドバイス、ありがとうございました。

回答No.1

trans55ketolase9

こんにちは。

ご質問の件はまず不可能です。

目的がわからないので的確なアドバイスかどうか自信ありませんが、お使いのベクターのEcoRIクローニングサイトの近傍の切りたい側に、一箇所だけしかない（インサートにも存在しないこと）他の制限酵素サイトはありませんか？
その制限酵素で切れば、とりあえずベクターとインサートがつながったまま一本になりますね。

ご参考まで。

お礼

実は、EcoRIの５’末端に新たにタグをつけようと思い、なんとか片方のサイトだけを切断したかったのですが、やはり難しいようですね。
何か別の方法を考えます。ありがとうございました。