PCR処理に用いる制限酵素

質問

PCR処理を行う場合、通常は酵素を反応液を最後に加えるのは何故ですか？

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

質問のタイトルは「制限酵素」になっていますが、PCRのときに入れるポリメラーゼのことですよね。

まず、酵素を一番後に入れるというのはポリメラーゼに限らず、ほかの酵素にも当もはまることです。一般論として酵素は迂闊に純水などで希釈してしまうと失活しやすいとからです。ちゃんとその酵素にあった反応用バッファーが準備できてから酵素を加えるべきなのです。

酵素を混ぜてからさらにほかの物をいれてまた混ぜるというのも失活のもとです。酵素以外のものをきれいに混ぜてから、酵素を加えて穏和に混ぜるというのが基本です。

ポリメラーゼ、特に校正活性を持つものに関しては、exonuclease活性によるプライマーの分解を防ぐという意味もあります。
dNTPが十分にない状態ではポリメラーゼはexonuclease活性をより強く発揮します。そのため、プライマーが分解されてまずいことになり得ます。
ですから、ほかの物をすべて混ぜ終わってから酵素を加え、速やかにサーマルサイクラーで反応をスタートさせた方がいいのです。