WBについて（基本的なこと）

質問

Western blottingについて聞きたいことがいくつかあります。
・ECLなどをメンブレンにしみこませ、発光（ケミルミ）させると反応が強すぎて「サチる」と言われる状態になりますが、この「サチる」ってなんのことですか？何故そうなるのですか？何故サチるという言葉なのですか（何かの略語ですか）？

・バンドが出たときに強すぎて中が抜けたようになってしまうことがあるのですが、これは何故ですか？「発色気質が強すぎる」とか言われたのですが、なんのことやら・・でした。

教えてください！よろしくお願いします。

回答No.3

MIYD · ベストアンサー

バンドの境界を設定する際にバンドがくっついてしまうことではなく、
範囲を指定したバンドの領域の濃さが測定値の上限を超えた状態です。

例えば濃さを0-1023で数値化する際に、
(範囲の平均値ではなく、各点の濃さです。バンドの濃さは各点の濃さの平均値X面積であらわされていると思います。）
測定値が1023になってしまい、
本当の濃さが1023よりも濃くても測定することが出来ない状態です。

その際に1023として測定された濃い2つのバンドの発光量に、2倍の差があっても、
測定することが出来ないために、同じ1023として測定されます。

お礼

なるほど～！分かりました。だからまさに飽和状態ってことですね。
では中抜けの方はもう測定するまでもなく測定不能になってしまうのでしょうか。
ありがとうございました。

回答No.2

MIYD

>飽和してしまうということで良いですか？
saturateしている状態では、バンドが真っ黒になってしまい、光り具合とバンドの濃さが直線に乗らなくなったために、他のバンドとの濃さを比較できない状態です。

>サチった状態とどう違うのでしょうか？

saturate→バンドが真っ黒で比較できない
中抜け　→反応が進みすぎて、フィルムに焼く前に反応が終わって光らなくなり、バンドの中央が白くなった状態
です。
どちらも過剰な反応が起きていますが、
検出される結果が異なります。
(saturate＜中抜けと考えていいと思います)

発光の際には基質が分解され尽くすと光らなくなるために、中抜けが起きます。

発色や蛍光やオートラジオグラフィー（や発光）では検出できる範囲がありますので、それを超えると、
他のバンドとの比較が出来なくなります。

お礼

なんとなく意味がつかめてきました。いつもWBの業務はやっているのですが、結果解析や定量をやらせてもらえないので発色剤をつけてExposeした後の事についての知識がなくて・・

定量する時は、バンドの境界を設定してそれを比べるのですよね。それがつながってたりすると検出ができないってことでよろしいでしょうか。
ありがとうございました。

回答No.1

MIYD

言われた人に聞くことができない特殊な状況なのでしょうか

サチる(saturateする)
フィルムなどで検出するさい、
直線性は無限にあるわけではく、ある程度を超えると飽和します

中抜け
酵素と結合した抗体量が多い場合、
染み込ませた基質が分解され尽して、発光しなくなります
バンドの中央部分に抗体が多く結合するため、
中央部分が白く抜けます

お礼

サチると言われる状態はつまり、ある抗体で当てたものがサンプル中にたくさん存在しすぎて飽和してしまうということで良いですか？

中抜けする理屈はなんとなく分かりましたが、サチった状態とどう違うのでしょうか？たくさんありすぎて、というのとは違うのですか？
基本的な事すぎて聞くの心苦しいのですが、聞くは一時の恥としのんでお聞きします。よろしくお願いします。