PCRがうまくいきません

質問

ALDH2遺伝子の変異を調べたくPCRを行いましたが上手くいきません。
条件は以下のように行いました。
ネガティブコントロールもサンプルも、すべて同じ20～30bpあたりにバンドがでてしまいます。
コンタミしたのかと思い、すべて試薬、水を新しいものに取り換えて、
ピペットもフィルター付チップに代えましたが同じ結果が出てしまいます。
プライマーは自分で作成したのではなく、ニッポンジーンで紹介されていたものを使用しています。
初心者で、どこを直したら良いのか分からず質問させていただきました。
どなたかアドバイスをください。

2×Ampdirect plus　　　　10.0μl
F-primer（50μM）　　　　　0.2μl
R-primer（50μM）　　　　　0.2μl
DDW　　　　　　　　　　　　　8.5μl
Nova Taq（Hot start）　　　0.1μl
DNA（ネガコンに水 ） 　　　1.0μl

94℃　2分 - （94℃　30秒 - 60℃　30秒 - 72℃　20秒）30サイクル - 72℃　5分

プライマーは、以下の２パターンです。TEで50pmol/μlに溶解されたものを購入
Ｆ-primer　5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3'
R-primer 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT C-3' （正常型）

Ｆ-primer　5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3'
R-primer 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT T-3' （異常型）

回答No.1

unaplasm

実験お疲れ様です。

予想増幅塩基数はいくつでしょうか？
その位置にバンドが現れないのであればサンプルでも増幅がおきていないことになります。
20~30bpに現れるバンドの正体はプライマーダイマーかと思います。
これについては別途お調べください。

増幅が起きない原因としては
１．実は鋳型DNAがとれてない、不十分
２．Ampdirect plusとお使いの酵素反応系(Nova Taq)との相性が悪い
といったことが考えられると思います。

もし精製済みヒトゲノムDNAがある場合、
genomeDNA＋Ampdirect plus＋Nova Taqの組み合わせの反応で増幅が確認できるなら１が原因
できないなら２が原因かと思います。

ご参考になれば幸いです。

お礼

回答ありがとうございます。
135bpにバンドが出るはずなのですが、ここには全く出ていませんでした。
Ampdirect plus＋Nova Taqではない他の試薬でもPCRをやってみたのですが
これも同じ結果だったので、DNAが不十分という可能性はありそうです。
Bio-RadのInsta Gene Matrixという試薬を使用して口腔粘膜から精製したのですが
上手く採取できていなかったのかもしれません。
サンプルの精製をもう一度やり直してみます。