PCRについて

質問

今実験でPCRを使用した特定遺伝子の定量を行っています。使用した遺伝子はラット骨格筋タンパク質です。
先輩の引き継ぎで再現性を調べるものなのに同じような結果になりません。
グループ内の個体差も大きく、ばらつきもあります。
なにかPCRの手順で悪い所があるとすると
1）DNAの作成がうまくいかなかった。
2）96Wellプレートのピペッティングミス
などでしょうか？うまく実験していくにはどのようなことに気をつけたらよろしいでしょうか？

回答No.1

DJ-Potato · ベストアンサー

とりあえず、何が問題なのかはっきりさせるために、あらゆる操作にポジティブ・ネガティブのコントロールを置くことをお勧めします。

同じ検体で同じ操作をしてもばらつきがあるなら、ピペッティングが下手な可能性もあります。
DNAを回収する時に元の検体量が少ないと誤差が大きくなり、元の検体量が多すぎるとカラムに目詰まりして収穫できなかったりします。

常温で長時間放置してDNAが壊れた、とかないですよね。
PCRの試薬が古いとか、先輩が使ったのと違うとか、サーマルサイクラーの設定が間違ってるとか、そんなベタなミスはないですよね？

お礼

DNAを作成する前にRNAを希釈し、トータルの量を同じにはしています。そこから目的遺伝子を採取しています。

DNAは氷中で解凍し、回収するときのみ取り出しをしていますので壊れる可能性は小さいかと…。
RNAサンプルからもう一度DNAを作成してみたら良いでしょうか…
とするとバラツキの一番の問題はピペッティングかもしれないですね…

ありがとうございました！

回答No.3

otx

＞先輩の引き継ぎで再現性を調べるものなのに同じような結果になりません。

まず、こういう実験をするときに確認する必要があることは、
各サンプル間で、「同じに発現量なるはずの遺伝子」が
同じになるように操作できるか、確認することです。

そのためには、ハウスキーピング遺伝子と呼ばれる、
ほとんどの組織や細胞で同じ量発現していると考えられる遺伝子

これをコントロールとして、今やっている作業が自分はきちんとできているか？
を検定します。

それを再現できる「腕」を持って初めて、変化があるかもしれない実験を行なうのです。

でないと、何が起こっているのかなんて論じても意味が全くありません。
実験を組み立てる時、「自分の腕は確かなのか？」ということを確認する実験系も
考慮して実験しなければ、さらに先の「変化を検定すること」なんて出来ないのです。

頑張って下さい。

お礼

ありがとうございました。参考になりました。
自分の腕に自信ができるほどのスキル身につけようと思います。

回答No.2

warudori

貴方が正しいのかもしれません。先輩が間違っているのかもしれません。
先輩が正しいのかもしれません。貴方が間違っているのかもしれません。

特に生体を使っていますので、生育条件にも大きく左右される実験なのかもしれません。

PCRだけに特化して考えれば、

１．ポジティブコントロールとネガティブコントロールを用意する。
２．RNA→cDNAという流れだと思いますが、

　　無傷なRNAであることを確認する。
　　ゲノムの混入のない、cDNAであることを確認する。

ことが大切です。

お礼

生育条件は飼料とも環境とも同じです。ただ去年と臓器重量に差が出てたりというのもあるので、全く同じにはならないだろうと考えてはいました。
RNAの段階では吸光度計での結果、活性も良く、純度は高かったです。
問題があるとすればDNAになってからですね。
明日さらに実験を進めて対策を練ります。ありがとうございました！