PCRについて

質問

PCRで目的の産物を増やした後，そのPCR産物を使ってもう一度同じprimerでPCRを行うと，1回目のPCRより多くPCR産物を取り出すことはできるのでしょうか?

回答No.1

MIYD · ベストアンサー

出来ますが、

PCR後の溶液をそのまま次のPCRに持ち込むと、
テンプレートやプライマーによっては非特異の増幅が起きて、
スメア上になる場合があります。
(バンドとして見えないけれど増えている非特異産物は結構あるようです)

一度泳動して切り出すなり、
そのバンドをつついてPCRをかけた方が非特異の増幅が抑えられますが、
http://www.biology.tohoku.ac.jp/lab-www/cellbiol/kojinn/oba/1cell.html
それでもサイクル数を増やすとスメア状になることがあります。

増やすサイクルは数サイクル位から始めて、
増え具合をを見ながら増やした方がいいと思います。

補足

おっしゃるとおり，PCR反応液を用いてもう一度PCRを行ったところスメア状になってしまいました．なぜこのようなことをしようかと思ったかというと，目的産物をシークエンスにかけたいのですが，ごく微量にか取れなくて，それをどうにか増幅してシークエンスできる量にまでもっていきたいと考えたからなんです．そのような場合どのような方法をとることが一般的なんでしょうか？

回答No.3

dadachan

原理的には可能です。
しかし、実際に多くのPCR産物を得たい場合には、最初のprimerを若干長い目に設計し、2回目のprimerで目的のものを取る方法が効率いいですよ。
つまり、目的のものを1000bpとした場合、1回目には1200くらいの産物を得るようなprimerにしておいて、2回目に1000bpの目的のものを得る、という方法です。

回答No.2

sirouto1gou

基本的には可能だと思います。
しかしながら、No.1さんの仰っております様にノンスペが出る可能性がありますので、5'エキソヌクレアーゼ活性のある酵素でのPCRをかけられた方が無難かと思います。ランニングコスト高いですけどね。
あとはdNTPsの量にも依ります。