PCR

質問

ALDH2をPCRで増幅しようと思い、実験で温度条件94℃15秒、48℃30秒、68℃10秒で行ったのですが、その温度条件の理由がわかりません。
教えてください。

回答No.2

otx · ベストアンサー

PCR法の原理を勉強してみてください。

（１）94℃は熱によってDNAを２本鎖から１本鎖にするステップです
（２）48℃は1本鎖にしたDNAにプライマーを結合させるステップです。
（３）68℃はポリメラーゼによってDNAを伸ばすステップです。

（２）の温度はプライマーのTm値によって変えます。
（３）の温度はポリメラーゼの最適な温度（68～72℃）です。

PCRの原理
http://kusuri-jouhou.com/creature2/pcr.html
http://www.nippongene.com/pages/products/pcr/taq03.html

Tm値について
http://www.genosys.jp/whatsnew/tm/tm_syosail.html
http://catalog.takara-bio.co.jp/product/basic_info.asp?unitid=U100004190

お礼

一つ一つ丁寧な回答ありがとうございます。
とても参考になりました。

回答No.1

geneticist12

>その温度条件の理由がわかりません。
理由というより、それぞれの温度ステップの意味ですが。

94℃ではDNA二本鎖を対合させている水素結合が切れるので、一本鎖に解離します。

速やかに温度を下げると（この場合48℃）一本鎖になったDNAにプライマーが対合します（annealingといいます）。プライマーは鋳型DNAに比べると非常に短く、大量に入っているので速やかにannealingします。一方、短いほど解離しやすいのでプライマーの長さ（それとGC含有率）に応じてannealが起こる温度まで下げてやる必要があります。いったんannealすると至適温度でなくてもprimerから伸長反応が起こるので、より長くより安定な二本鎖になります。

68℃は耐熱性ポリメラーゼが伸長反応する至適温度です（72℃の方が一般的ですが、反応に応じて68℃も使われます）。このステップは、どれくらいの長さをPCRするかによって時間を変えます。1 kbにつき1分というのがおおよその目安です。

お礼

一連の流れがよくわかりました。
とても勉強になりました。ありがとうございました。