PCRの 5’・3’ が分からず困っています

質問

PCR で使われる5’と3’の表記で困っています。
実習でPCRとプライマーの設計デモをやりました。ソフトウエアを使ってプライマーを設計すると、いくつか候補が出ます。これは、3―・・・ ―5’で表示されるのが一般的だと教えられました。実際の実習では、既に準備されたプライマーを使ったんですが、プライマー合成した会社からの詳細コピーも配られました。そこには5’―・・・ ―3’と明記されており配列は同じでした。もし、5’―・・・ 3’の方向で書くのら、配列はソフトウエア上で出たものとは逆になるはずでは？設計デモの時、チューターからは「プライマーの始まりはGCリッチに」とも言われました。3’末端の配列はGかCが望ましいという条件があることから考えると、やっぱりプライマーの始まる方を3’として、配列は、3’―・・・ ―5’で記載するのが一般的なのだろうなと想像してます。
よく本には以下のような模式図が出ています。
5’―・・・ ―3’　
3’―・・・ ―5’　　
の2本鎖が熱で、5’―・・・ ―3’　と3’―・・・ ―5’　という1本鎖に別れる。で、5’―・・・ ―3’　の鎖では　鎖の3’側へ　5’―・・・ ―3’　のプライマー（これがリバースプライマー！？）がくっ付いて、プライマーの5’を起点にして5’→3’方向へDNAが合成される。　
3’―・・・ ―5’　の鎖でも　鎖の3’側へ　5’―・・・・ ―3’　のプライマー（こっちがフォワードプライマー！？）がくっ付いて以下同様。
だとしたら、プライマーの配列が3’から記載されるのはおかしいと思うのですが。
プライマーの配列そのものの向きではなく、プライマーがアニールするテンプレートの配列を基準に　3’と5’を考えているということなんでしょうか？

回答No.3

sachihappy777 · ベストアンサー

こんにちは、No.1です。
>これは、プライマーがアニールしたら５’→３’方向へ伸長が起きる からプライマーの３’末端が伸長の起点になる、ということで、プライマー配列の３’の方を“始まり”と言う人もいるってことでしょうか？

私もそうだと解釈しています。
3`が起点（ポリメレースによる伸長の始まり）でPCR産物で考えると反応の終止点となるのがもう一方のプライマーの5`となるからだと思っています。

＞人によって3`が始まりや開始点と言う場合はあっても、本や実験マニュアル等に出ているようなプライマー設計の際の注意事項は、プライマーが５’→３’で表記されていることが前提、と考えていいですよね？

前提というか、文献を読んでもらうとわかるのですが、塩基配列を3`側から書く人はいませんよね。プライマーも塩基配列ですから、5`から表示するのが自然だとお考えください。

マニュアル等に書かれているプライマー設計の注意点はきちんと「5`側」、「3`側」と書かれていると思います。開始点等の言葉にまどわされる必要はありません。

余談ですが、5`末端にGC配列を多くするというのは結合を強めるための意味合いがあります。AとTの結合よりGとCの結合のほうが強いからです。

定量PCRのプライマーも全く同じです。

補足

sachihappy777さん
ありがとうございます。とても丁寧に解説して頂いて、すごく勉強になります。

＞5`末端にGC配列を多くするというのは結合を強めるための意味合いがあります

最初のアニールを確実にできるように、ということですよね。

自分でPrimer3を使ってデザインしてみましたが、理想条件に合うのがなかなか無くて難しいです。

5’末端もさることながら、3′末端配列 もミスプライミングを避けるためにGまたはCにすると良くて、ただしGCリッチすぎると非特異的にアニールしてしまう。3′末端塩基がTだとミスマッチでもアニールしてしまいやすいから避ける。 この条件をクリアするのがかなり困難に思いました。

すみません、まだご覧になられていらっしゃいましたら、ひとつ教えて下さい。
プライマーの3’末端塩基にTはダメと言われますが、Aは大丈夫なのでしょうか？A-Tのプリン塩基同士の結合が弱いからという理由であれば、相手塩基がAでもTでも同じではないかと思ってしまうのですが。

回答No.2

sachihappy777

primer3でしたら、オンラインでも検索できるソフトウェアです。
私も実際に使っています。

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

primer3で設計しますと、配列の向きは5`→3`で記載されます。
Primer3はオンラインでのフリーウェアですから、一度御自分で設計されてはいかがでしょうか？（適当な遺伝子配列をとってきて）
Primer3でleft primerとあるほうが3`→5`にくっつくプライマー
right primerとあるほうが5`→3`にくっつくプライマーです。

遺伝子配列の表記は5`→3`が一般的な表記なので5`→3`でプライマーも表記されるのだと思います。（一応遺伝子配列には変わりないですから）
実際の働きを考えると3`がはじまりや開始点、終止点という表記が出てくるのでしょうね。

補足

ありがとうございます。自分なりに理解できたと思います。

もしまだ見ておられたら、３つ教えて頂けると嬉しいのですが、

＞実際の働きを考えると3`がはじまりや開始点、終止点という表記が出てくるのでしょうね

これは、プライマーがアニールしたら５’→３’方向へ伸長が起きるからプライマーの３’末端が伸長の起点になる、ということで、プライマー配列の３’の方を“始まり”と言う人もいるってことでしょうか？

人によって3`が始まりや開始点と言う場合はあっても、本や実験マニュアル等に出ているようなプライマー設計の際の注意事項は、プライマーが５’→３’で表記されていることが前提、と考えていいですよね？

プライマーを５’→３’で表記するのは、定量PCRのプライマー設計でも同様ですよね？

回答No.1

sachihappy777

使用されているソフトウェアがわからないのですが
５→３の表記が一般的なのではないでしょうか。

ソフトウェアのプライマー合成時の表記ページにも
元の配列の何番目から何番目までにプライマーが対応しているという表記がされますので５→３となると思います。

プライマー合成表とソフトウェアの結果の配列が同じとのことで
チューターの言い間違いか、勘違いではないでしょうか。

補足

さっそくの回答ありがとうございます。
ソフトウエアは、primer3というものでした。
やはりチューターの言い間違いでしょうか。
インターネット等で調べてみたのですが、
http://www.jarmam.gr.jp/situmon/pcr_primer.html
という記載を見つけて更に混乱しています。