ALDH2遺伝子を増幅する際のプライマーは？

質問

ALDH2(アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ２)を持つ人(Normal)と持たない人(Mutant)を判定する実験を行っています。
NormalとMutantは１塩基多型であり、Normal用プライマーとMutant用プライマーの両方でPCRを行い、どちらのプライマーで増幅が起こるかによって遺伝子型を判定しています。

この実験のプロトコルがニッポンジーンのホームページ上にあるのですが、用いるプライマー(Reverse)の塩基配列を調べたところ、

Forward : 5'-CAA ATT ACA GGG TCA ACT GCT-3'
Reverse－Normal : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT C-3'
Reverse－Mutant : 5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT T-3'

となっています。
ところが、Reverseが結合する部分のDNAの塩基配列は

Normal：3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGＴ GAA G-5'
Mutant：3'-GGT GTG AGT GTC AAA AGＴ GAA A-5'
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　↑
であり、↑部の塩基「T」はReverseとはミスマッチになっています。Reverseのこれに対応する部分は「A」になるべきではないでしょうか？

不思議に思い、早速、ニッポンジーンに問い合わせたのですが、ニッポンジーンではT.Takeshita(1994)の論文を参考にしており、ミスマッチ部の「T」を「A」にしてＰＣＲを行ったデータは持っていないとのことでした。

このプライマー設計にはどのような意図があるのでしょうか？

回答No.1

Freeuser · ベストアンサー

参考URL、Methodsの第一段落に書かれていますが、

プライマーは5'-CCA CAC TCA CAG TTT TCT CTT
をつかっていて、
件の位置にmutationを入れることで、ALDH2が正常な人ではCTCTTCという制限酵素Ksp632Iの認識配列ができます。
増幅断片がKsp632Iで切れるか切れないかで判定していたようです。

ニッポンジーンのプロトコルはそれの名残ではないでしょうか。

参考URL：

http://ehp.niehs.nih.gov/members/1996/Suppl-3/563-567morimoto/morimoto-full.html