突然PCRがうまくいかなくなりました

質問

PCRについての質問です。
これまで普通に増幅できていたのに、突然PCRがうまくいかなくなりました。
コンタミなどの影響も考え、抽出精製などを行ったのですがやはりうまくいきません。何か他に考えられる原因はないでしょうか？
サーマルサイクラーが正常に動作しているか確認するための診断テストをしたところ、94℃から40℃に冷却する場合の最大冷却速度が規格値より0.2℃/secほど低くなりました。この0.2の差というのは反応に影響するものでしょうか？
また、フェノクロが劣化していた場合にPCRに影響を与えることなどはありますか？
困っています。どなたか教えていただけると嬉しいです。

回答No.1

noname#17364 · ベストアンサー

こんにちは。
　サーマルサイクラー云々は、わたしは関係ないと思います（多分）。
　それより、PCRというのは初めてのテンプレート、プライマーペアの話ですか？もしそうなら、今までに実績のある、必ずかかるテンプレート、プライマーでやってみたらいかがでしょう。まずはこれを確認した方が良いでしょうね。もしこれがかからなければ、PCRの試薬の問題ではないでしょうか？酵素が失活しているとか。
　それをクリアーした上で、それでも初めてのテンプレートとプライマーペアで増幅できない、と言う段になったら、実にいろいろな要因が考えられますよね。PCR関連の実験書をひもといて、ひとつひとつ条件を確認するしかないと思います。
　フェノクロが古くてpHがくるっているとDNAがフェノクロ側にロスされてしまう、とはよく実験書に書いてありますよね。心当たりがあるなら作り直した方が良いかもしれませんよ。

補足

初めまして。丁寧な回答をありがとうございました。
テンプレートとプライマーの件ですが、これは今まで使用していた組み合わせで
増幅もきちんとできていることを確認しています。それが突然かからなくなったのでおかしいなと思い、試薬の問題も検討したところです。
すると、別のテンプレートとプライマーの組み合わせではきちんと増幅ができたので、試薬の問題でもないことがわかりました。
一般にいわれているような原因は一応試したつもりなのですが、
なぜかうまくいかないのです。プライマーがこわれていたりするのでしょうか・・・？もう少し検討してみます。どうもありがとうございました。

回答No.2

noname#17364

こんにちは。
　いやー、私の経験だと、プライマーがダメになるってことは、普通に使っている分にはまずありえないとおもいます。
　それよりも、テンプレートの劣化でしょうか？そのテンプレートで、何かハウスキーピングジーンでもインターナルコントロールにしてかけてみてはどうでしょう。
　一般的な回答しかできませんが...。PCRがかからない悲しさ、わかりますよ。がんばってください。