ウエスタンブロットでのフィルム感光について

質問

ウエスタンブロットを行い、メンブレンに転写し、ブロッキングしたあと、
フィルムに感光してバンドを確認してるのですが、その際、バックグラウンドが
濃くなり、バンドがきれいに見えません。何かいい方法はないでしょうか。
メンブレンのメーカーや種類が関係してるのでしょうか？メンブレンはニトロセルロースで、アドバンテックを使用してます。
よろしくお願いします。

回答No.2

noname#53364 · ベストアンサー

いくつかあげてみますので興味があれば試してください。
バックが高くて真っ黒になってしまうのですよね？

１．ブロッキングの濃度を上げる。
２．２次抗体の濃度を減らす。
３．２次抗体の反応時間を短く。
４.１次抗体を４度でオーバーナイト。
５．高いけど一部のモノクロで売られているHRPつきのものを使う。
６．ウォッシュの回数と液量を増やす。
７．２次抗体の前にもう一度ブロッキングを入れる。
８．ECL+つかっているならECLに変える。感度は下がるが見えるものは見える。

まだまだありそうですがとりあえず。
実用的なものから、そんなに効果が望めないものまであります。
順番は関係ないです。

２，３，５,８あたりは試しても良いかもしれません。

個人的にはＰＶＤＦよりニトロセルロースでバックが少ない気がします。
クルードサンプル、免沈サンプルだとどうしても汚くなります。
検出限界まで量を減らしてバックを減らすこともありますがというていど。

研究にさわりのない程度の情報を書いてくだされもう少し絞れるかもしれません。

補足

ブロッキングの濃度は、５％スキムミルク
2次抗体は1000倍で、室温1時間インキュベートしてます。
ウオッシュはPBSで10min3回程度です。
初歩的な質問かもしれませんが、ECLとは何ですか？

回答No.4

noname#53364

まだ回答を締め切っていないので補足です。

メンブレン染めるときは、NCならCBBはだめですよ。
溶けます。たまにやっちゃう人がいます。

ポンソーＳで染めましょう。長期保存にはCBBがよいです。
PVDFなら大丈夫。

私はうまくいかなかったときのチェックのために
ゲルも残しておいておかしいときは染めます。

メンブレンも明らかな時以外は染めるようにしています。
（手間でないから）

できるだけ原因は詰められるようにしておきましょう。

あと回答も適当なところで締めてね。

回答No.3

noname#53364

ECLについては参考ページを参照してください。

WashにTween　20は入れてないのですか？
私はファイナル０．０５％で入れてます。
ＴＢＳを使っていますが変わらないと思います。

参考ページにいろいろいろありますのでそちらも参考に。

経験ですが、メンブレンをあとで染色してみて、レーンが
塗りつぶされているほどタンパクをのせているとどうしても
黒くなります。検出できるならばタンパクを減らすことでバックは落とせます。
バンドがラダーに見えているぐらいまでならほとんどバックなしです。
長焼きすると黒くなりますけどね。

何かありましたらまたどうぞ。

参考URL：

http://www.jp.apbiotech.com/products/kouryaku/Chap_7/ECLPlus.asp

お礼

いろいろありがとうございました。
早速、やってみます。
メンブレンを染色するのはいい方法ですね。
また、他の実験もしてるので何かありましたら
聞くと思います。
ありがとうございました。

回答No.1

betajini

今はニトロセルロースより、PVDF膜が一般的なのではないでしょうか。
ニトロセルロースの使用経験はありませんが、
バックが高く、膜の強度が弱いということを聞いたことがあります。
バンドの出るべき高さはわかっているのでしょうか？
もし、メインの出るべきバンドがあるなら、
露光時間の調整だけで対処できる可能性はあると思います。
もう少し情報(状況)を追加してください。

補足

ブロッキングの濃度は、５％スキムミルク
2次抗体は1000倍で、室温1時間インキュベートしてます。
ウオッシュはPBSで10min3回程度です。
認識バンドは３０ｋD付近です。