PCRとプライマーの融解温度

質問

今度の化学の実験でDNAの電気泳動実験をやります。課題で、調べてプライマーの融解温度を計算しなければならないのですが、いろいろ調べてみても計算の仕方がよくわかりません。

プライマーの配列は
Primer#1:5'-GATGAGTTCGTGTCCGTACAACTGG-3'
Primer#1:5'-GGTTATCGAAATCAGCCACAGCGCC-3'

で、使う式は

Tm＝81.5+16.6×logO.047＋0.41×GC％－500/n

なんですが、このGC%とnと5'(3')の意味がよくわかりません。どうやって求めるのでしょうか？初心者でもわかるように教えていただけないでしょうか？

回答No.3

Dr_Hyper · ベストアンサー

Ｔｍ(℃)=81.5+16.6*log[S]+0.41*(%GC)-(500/n)
の計算式が大元で、
[S]　　　：塩のモル数　
(%GC)　：オリゴヌクレオチド中のＧとＣ含量（％）
n　　　　：オリゴヌクレオチドの長さ(pb)
となっています。塩濃度[S]は通常Na+イオンのモル濃度を差すがＰＣＲ反応液の場合次のルールで計算します。
１.　Ｋ+イオンはそのまま加算する。
２.　Trisイオンは0.65倍して加算する。
３.　Mg2+イオンは計算に入れない。
たとえば、ＰＣＲバッファーの塩濃度が以下の場合には
50mM KCl
10mMTris-HCl (pH 8.4～9.0 at 25 ℃)
1.5mM MgCl2
なので、[S] = 0.05 + 0.67*.01 = 0.0567 (M)
よって、計算式は
Tm(℃)=60.8+0.41*(%GC)-(500/n)
となりますね。ご参考までに。
まあ参考URLに配列をいれると大体の値は出してくれるのですが。。。。
教育的にはどうかともいますけど。

参考URL：

http://www.riken.go.jp/lab-www/help2/members/kagawa/tmnumber.html

お礼

ご親切にありがとうございました。大変勉強になりました

回答No.2

otx

忘れていました。
５’、３’ですが、

この図を参照してください。
http://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/1/1d/AGCT_DNA_mini.png

この図で小さく５’、３’と書いてあると思います。このことです。
簡単に言うと、
DNAはヌクレオチドからできていますが、それが結合するのは
そのリン酸と糖のところです。

化学はよくわからないので下記のURLを参照してください。
http://mambo.kuhp.kyoto-u.ac.jp/~nonn/cpu/3.htm

Tm値を出すのには関係ありません。

お礼

勉強になりました！

回答No.1

otx

GC%というのは、そのものズバリ
プライマーの中のGとCの含まれる割合です。
GとCを数えてすべての塩基数で割ってパーセントを出すだけですよ。

nはプライマーの塩基数です。数えるだけです。