GCリッチなプライマーを使用してのPCR

質問

PCRで目的物が増えてこなくて困っています。

Oligo Calculatorによる計算では、片方のプライマーが23mer, GC率70%, Tm値64℃で、もう一方は30mer, GC率53%, Tm値64℃です。アニーリング温度を変えたり、サイクル数を増やしたり、template量を変えたり、これより短いプライマーを試した（これより長くしても前者のGC含有量は減らない）のですが、アガロース電気泳動でバンドは検出できませんでした。

原因として考えているのは、
(1)これらの２つのプライマーには、各々のプライマーの中央付近に７bp程度、相補的な部分が存在しているので、プライマーどうしでくっついてしまっている。
(2)前者のプラマーがGC含有量が多いので、プライマー内でGC結合してしまっている。
(3)ポリメラーゼが適切でない（New England Biolabs Vent Polymerase）。
ということです。

(1)の解決策として、相補的な領域が少ない短いプライマーを試したのですが、バンドは検出されませんでした。

この問題の解決法を教えてください。お願いします。

回答No.1

wriwri · ベストアンサー

PCRで増幅させたい領域のGC-Contentは高いですか？あるいは、その領域にGC－Richな部位はありませんか？　

１）Invitrogenから出ているGC-Richによく働くPolymeraseを試す。
２）反応液にDMSOを５％（V/V）添加する。
３）最初の９５Cのステップを３分にする。
４）２－Step　PCR-Reactionを試す。

このあたりから反応条件をOptimizeしたら如何でしょうか？

お礼

ご丁寧な回答をどうもありがとうございます。さっそくDMSOを加えてPCRを回しています。GC－richな部位は主に増幅したい領域の最初の方にかたまっていて、トータルでは52%程でした。この場合も、GC-richによく働くpolymeraseは有効なのでしょうか？
ちなみに、どうしてもインサートが増幅されない場合、プライマーの一部にベクターの配列を組み込んでPCRをかけることは可能なのでしょうか。この場合、PCR産物に数塩基余分についてしまいますが、これが今後の実験（細胞内での発現など）に影響を及ぼすことはありえるのでしょうか。

回答No.3

wriwri

GCのかたよりがあるようですが、勿論GC-Richに有効なPolymeraseはとてもよく働いてくれます。

ところで、プラスミドがTemplateなのですか？

実験の目的がよくわからないので見当はずれかもしれません。
１）Templateはきちんと精製されていますか？A260/A280の比が最低でも１．９ぐらいないとコンタミしているタンパクの影響が出てきます。

２）プラスミドがTemplateであるならば、MCS内の制限酵素をうまく選べば、目的としているインサートを切り出すことが可能だと思いますが。

ベクターの一部の配列をプライマーに入れるという意味が解りかねますが、説明して頂けますか？

ちなみに、数塩基ぐらいでしたら、後にSite-directed mutagenesisで取り除くことは可能です。

お礼

DMSO添加し、アニーリング、伸長温度を少し上げたらでバンドが見えました。DMSOすごいですね。本当にどうもありがとうごじました。

回答No.2

RNase_P

No.1の回答とも被りますが

最初に試すべきは
1)DMSOの添加
2)PCR開始時の高温stepの温度を上げる、又は長くする
3)2step PCR
あたりでしょうか。
このあたりならほぼ追加コスト無しに試すことができますので。
primerが高次構造をとるようでしたらPCR前に
primerを高温から急冷するのも効果的かもしれません。

それでも駄目なようでしたら酵素をかえてみるのがいいと思います。
TAKARAのPrimeSTAR GXLやNEBのPhusion(GC buffer)他
色々あると思います。

お礼

ご丁寧な回答をどうもありがとうございます。さっそくDMSOを加えてPCRを回しています。ちなみに、どうしてもインサートが増幅されない場合、プライマーの一部にベクターの配列を組み込んでPCRをかけることは可能なのでしょうか。この場合、PCR産物に数塩基余分についてしまいますが、これが今後の実験（細胞内での発現など）に影響を及ぼすことはありえるのでしょうか。