組み替えを行なうPCR

質問

Codon usageをウイルスから大腸菌に変更するために、長いオリゴプライマーを設計しPCRを行ないました。電気泳動で確認した結果、目的とする555bp付近にはバンドが見られませんでした。条件を変えてやって見たのですが上手くいきません。なにか良い方法をご存知の方がいらっしゃれば教えてください。ちなみにプライマーの情報や変更した条件は以下の通りです。よろしくお願いします。
＜プライマー＞
5'側　60mer Tm値 76.9℃ 3'側 66mer Tm値 74.1℃
＜条件の変更点＞
Annealing温度
テンプレート濃度
プライマー濃度

回答No.1

geneticist12 · ベストアンサー

それほどに長いプライマーだと、TmはオリゴDNAプライマーと同じ計算方法だとずれてきて適用できないはずです。実際にはもっと高いと思います。また、長いプライマーは、短いプライマーよりAnnealingに要する時間が長くなってきますから、温度を振る以上に時間を振る必要があると思います。

一般に、長くてTmの高いプライマーでPCRするときは、touch-down PCRをします。annealingのための低温のステップを省き、denature (94℃）->annealing/extension (68℃または72℃）を繰り返す方法です。

お礼

annealing温度を振った段階で結果的にannealingの低温期間は省かれていましたが、時間を振るというアイデアは出てきませんでした。貴重なアドバイスをありがとうございました。