学生実験のPCRについて教えてください

2006/01/13 01:42

このQ&Aのポイント

PCRとゲル電気泳動の学生実験で困っていることについて教えてください。
PCRのサイクル数がmRNAの発現にどのような影響を与えるのか教えてください。
電気泳動で検出されたバンドを解析する際にどのような方法があるか教えてください。

takkatyan
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生物学
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ベストアンサー

kshimo
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2006/01/13 17:43 回答No.3

(1)検出された電気泳動のバンドに関して、25サイクルの時のODと30サイクルでなぜ違いがかなりあるのか？ PCRの原理を見ると理論上２のｎ乗（n=サイクル数）で PCR産物は増えていきます。そのため25と30サイクルだと2の5乗の違いが出ますただ、実際やってみるとわかるのですが鋳型量が多かったりするといち早く PCRが限界量まで増えてしまうことがありますそれはPCRが進むことでｄNTPやプライマーが失われたり、酵素が失活するためです。 25サイクルよりも前にプラトーに達するようですと２５と３０の間に差は大してなくなります。 (2)全くバンドが検出されないサンプルもあるが、それはなぜか？一言で言うとPCRがうまくいっていないということですね。プライマー設計が悪い。鋳型の状態が悪い作業的なミス（入れ忘れなど） Tm値などのプログラムミスこういったところでしょうか目的のものがあるか無いかという実験であれば無い (3)mRNAの発現を正確に行うのになぜPCRのサイクル数が重要なのか？ｍRNAの発現量を観察する場合はほとんどの場合、いったんｃDNAに逆転写してその後、そのRT-PCR産物を鋳型として通常のPCRを行います。肝心の目的物の量を測る方法はいくつかあるのですが最も簡単なものはPCRがプラトーに達する前に PCRを止め（20サイクル程度）電気泳動後ゲル染色やサザンブロットによって目的産物量を可視化、定量します。ｍRNA量が多い＝鋳型量が多い＝同サイクル数ならより強いシグナルとなるわけです。もう一つの方法はリアルタイムPCRと呼ばれる方法で検出試薬にサイバーグリーン（2本鎖のみが検出される）を用いて1サイクル進むごとに PCR産物量をシグナルから算出する方法です。「ライトサイクラー」で検索するとその機器がどういうものかわかると思います。これを使って「ある一定量にPCR産物が達するときのサイクル数」を求めます。ｍRNA量が多い＝鋳型が多い＝より少ないサイクル数で一定量に達する (4)電気泳動で検出されたバンドに関して、bpを解析する際にサイズマーカーの位置と比較する以外にどう考察・解析したらいいのか？目的のバンド以外があるのか無いかも重要です。 PCRの特異性は実験によっては非常に重要になるからです。低分子側にもわっとしたシグナルが多いとプライマー設計やPCR条件がゆるく、プライマーダイマーができているとかいうことも電気泳動像から見ることができますね

質問者

お礼 2006/01/15 17:04

ありがとうございます。自分が悩んでたことにほとんど答えていただいてなんとかレポートの仕上がりにもゴールが見えてきました！後は考察をがんばるのみです。

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MIYD
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2006/01/13 13:59 回答No.2

1) 比較しているのがバンドなのかODなのか質問文が良くわかりませんが、 PCRの1サイクル中に何が起きているのかを調べてください 2) 増えない反応液と、増えた反応液の組成(もしくはtemplateにしているもの)を比較してください。もしくは操作を間違えて、何か入れ忘れたためにまたは余分なものを入れてしまったために増えていないのかもしれません。 3) サイクル数とPCR反応産物の濃度の関係はこんな感じになります。 http://bio.takara.co.jp/catalog/application.asp?ID=1944 (色の違いはおそらく増幅するmRNAの濃度です) この中の特に http://bio.takara.co.jp/catalog/images/3702e.gif の図を見てください。 4) いいアドバイスが思いつきませんが、 (市販のサイズマーカーを使っていないという意味で) すでに何bpかわかっているポジティブコントロールと比較して上か下か同じかを調べたり、塩基配列を読むことによって何bpか調べることもできます。