ロングプライマーでのPCR

質問

通常のPCRは20mer程度のプライマーで行います。しかし、現在実験の過程で70merのプライマーを使ってPCRをしようと考えています。これほど長いプライマーでPCRは可能でしょうか。また、可能ならPCRを行う段階での注意点を教えていただけないでしょうか。ちなみに、TM値を計算したところforward、reverse共にTM値が71でした。

回答No.3

MIYD

変性と、アニール＆伸長反応の2段階で行うという意味です。

回答No.2

rimgojam

可能ですが、精製されたプライマーを使用することをおすすめします。(ゲル精製)70merで注文しても、ほとんどの分子がそこまで長くないです。
通常よりも特異性が高いので、伸び難いので、工夫してみる必要があると思いますが、tm値が71度と高いなら2stepPCRがいいと思います。ただ、TM値はあくまでも目安なので、実際にグラディエントをかけたほうがよいです。

回答No.1

MIYD

two step PCRで出来ると思います。
アニーリングと伸長反応を72℃で、
増やしたい長さと使う酵素に応じた時間をかけます。

増えない場合には、アニーリング温度を少し下げることもあります。

注意点は、プライマー合成時に十分に反応していないものがでてきて、
プライマーがデリーションしていたことがあります。

お礼

返答が遅くなって申し訳ありません。回答ではtwo step PCRでできるとのことでしたが、RT-PCRを行うということでしょうか。