オリゴマーのアニーリング

質問

ベクターの構築をやっているものですが・・・
８０～９０bpのオリゴマー(sense, anti-sense)を購入し、これらをアニーリングして（プライマーダイマー形成風に）ベクターへ導入しようと思っています。
両端はHindIIIとXhoIサイトをもうけています。
しかし、なかなかうまくいきません。もしかしてアニーリングに問題有り？と思っています。通常のプライマー程度の長さでしたらTm値は高くてもせいぜい８０℃くらいですが、９０merとなると１００℃を越えるんじゃないかなーと。
まだ修論までは１年ありますが、困ってます。お願いします。

回答No.3

Grace-Wonder · ベストアンサー

私は同じような実験をしましたが、なかなかベクターは出来ませんでした。そこで以下のような工夫をしました。
　アニーリングの後、High Conc.の制限酵素を用いています。これは、オリゴマーだと同じグラム数でも、サイトの数は非常に多いことを念頭に入れています。　
　さらに、それを非変性アクリルアミド電気泳動で分離し、アニールしたサイズのDNA断片を切り出し精製し、ライゲーションに用います。切断で生じた末端のオリゴマーの再Ligationを防ぐためです。小分子は思ったより、分子運動が激しく、反応効率が高いようなので、除去操作が必要なようです。
　その際、同様な原理で
　タンデムにインサートが繋がる確率の方が高いため、通常のインサート量（モル比で）よりも減らして、ベクターを多めにして実験を行っています。

お礼

どうも、この間のCREBの話題でもお世話になってしまい・・・ありがとうございます。
やはりアクリルアミドゲルでの精製の方がいいみたいですね。どうもアガロースでは分離しきれないみたいで・・・一応は両端切断後、アガロースで切り出してはいます。
あと、タンデムでインサートが繋がるという話ですが、以前に得たプラスミドはインサートの長さが７倍になってたこともあります。教授は有り得ないということで叱咤激励（キレられた）してもらいました。
ところで、下に書きましたpGEM-TへのライゲーションはダイレクトＰＣＲでのチェックでちゃんとできているみたいです。あとはインサートを切り出してレポーターベクターへ入れるのみです。
うちの研究室はドクターはいなくて助手、講師もいないのでなかなか方法論での相談役という人がいないのでここでちょくちょく聞いているのですが、またみなさん宜しくお願いします。

回答No.4

Grace-Wonder

すみません。No３ですが、結論として、これでばっちりうまく行ってます。

お礼

どうも、いれちがいだったみたいで・・・御返事書いた直後でしたね。
わざわざありがとうございます。別のヤツもあるんで一度やってみます。

回答No.2

ice_rif

No.1の回答の通り、アニーリングの問題ではありません。

コントロールＤＮＡのクローニングはうまく行きますか？
両端の制限酵素サイトの切断はうまく行っていますか？

お礼

コントロールのライゲーションは結構いい効率でworkしています。

double digestionですが、ベクターでは切れていることは確認できています。
でも、この対象のオリゴに関しては切断しても塩基数があまり変わらないので確認できていません。切れていることを祈ってやっています。
この問題もあったので、平滑末端でのクローニングも行ったのですが、入った試しがありません。今、pGEM-Tでのクローニング中です。入ることを祈ってやってください。

回答No.1

blackdragon

よっぽどGCリッチじゃ無きゃ、いくら鎖長が長くてもせいぜい８０°Ｃ台なんじゃないですか。
だって、PCRするとき、ディネーチャーの条件は９４°Ｃ程度でしょ？
(ある程度の長さを越えると、Tmは、長さとはほぼ無関係になります。)
というわけで、よっぽど塩濃度が高いとか、GCリッチとかじゃなければ、ディネーチャーの
問題ではないと思います。

むしろ、アニーリングをゆっくり行うとかいうことの方が大事かもしれません。
(急に温度を下げないで、PCR装置で温度変化速度を設定して、ゆっくり冷ますとか)

あとは、内部にInverted repeatがあったりすると、厄介かも知れません。
分子内構造をとるのを抑えて、分子間のアニーリングを優先的に起こすためには、
オリゴの濃度を高めにするといいかもしれません。

お礼

>だって、PCRするとき、ディネーチャーの条件は９４°Ｃ程度でしょ？
あーそういえばそうですね。納得しました。

アニーリングは、１００℃の湯浴からそのままお湯の中で放置しています。
一番ゆっくりの温度変化かなーとおもって。

この配列はあるcis elementを３つ連結したヤツです。オリゴの濃度を高くすることを一度やってみます。