DNAシーケンス

質問

DNAシーケンスがうまくいきません。
800bpのPCR産物をTベクターに組み込んでおり、M13ForwardとM13Reverseのプライマーを使用し、両方向からシーケンスしています。
M13Reverse側からはうまくシーケンスできるのですが、M13Forward側からはうまく読めません。
同じプライマーを使って、ほかのプラスミドをシーケンスするとうまくいくのですが、このサンプルはForward側から読めません。

使用しているシーケンサーはABI3730　キットはBig Dye V3.1です。
サンプル量、プライマー量はキットで推奨されている量を使用しており、Big Dyeは1／4希釈です。
何度シーケンスしても読めないのですが原因は何が考えられるでしょうか。また、、何か解決策はあるでしょうか。

回答No.2

noname#44146 · ベストアンサー

M13ForwardプライマーがPCR産物内部の特定の配列とinteractしている可能性がありますね。

・Tベクターのforward側の別のプライマーを試してみる
・No.1さんがお答えのようにreverse側から読み進める
・PCR産物が逆向きに挿入されたクローンを鋳型にしてM13reverseで読む

以上のような対策をご検討してみてはいかがですか。

補足

早速のご回答ありがとうございました。
PCR産物内部にinteractしている可能性は今まで考えたことがありませんでした。
TベクターのForward側のプライマーはほかにも手持ちでありますので
それで読んでみるのが取り急ぎできる手段だと思いますので、
やってみようと思います。
ありがとうございました。

回答No.4

tomoyaok

ＡＢＩのトラブルシューティングを参考にして下さい。
ＵＲＬ下に書いておきます。

その他にも「ＧＣたくさんでも読めますキット」が
どこかから出ていたような、、、。
出入りの業者かＡＢＩの技術者に聞かれたらいかがでしょうか。

参考URL：

http://www.gelifesciences.co.jp/tech_support/faq/seq/et.asp

お礼

ありがとうございました。
Reverse側から読んでみて、また反応が阻害されるようであればキットの購入等も考えてみようと思います。

回答No.3

tomoyaok

＃２に加えて、

インサートのＦ側が
・ＧＣ含量が多い
・ステムループのような構造的な問題
があることによって

反応が阻害されているかもしれません。

補足

ご回答ありがとうございました。
ご指摘のように、F側にシーケンスで読みにくい配列があるのかもしれません。
内部の配列がまだ未決定なので、R側から読み進めていきたいと思います。
しかし、もしそのような読みにくい状況ならば、Reverse側から読んでも反応が阻害されてしまう可能性もありますよね。
その場合は、どのように対応していけばよいのでしょうか。
よろしくお願いします。

回答No.1

miya_0726

お使いのTベクターのプライミングサイトに、お使いのM13forwardプライマーが貼りつくか確認されましたか？

http://bio.takara.co.jp/catalog/catalog_d.asp?C_ID=C0374

このようにM13forwardだけでも4種類あって、ベクターによっては使えないものがあったはずです。

もし同じベクターを用いた別のサンプルで同じM13forwardプライマーで読めているのであれば、欠失が起こっていたりするのかもしれません。何度やっても読めないのであれば、私ならM13reverseで解読できたインサート内でプライマーを設計し、読み進めてしまいますが・・・。そうすればM13forwardプライミングサイトで何が起こっているか知ることもできますし。

いかがでしょうか？

補足

早速のご回答ありがとうございます。
M13プライマーについては確認済みです。
インサートの配列がわからなかったので、ベクターのプライマーを用いてシーケンスを行っていたのですが、Reverse側から読み進めていくのも一つの手ですね。
しかし、今後、同じベクター、同じプライマーを用いて、読めたり読めなかったりとなるのは・・・・。
一度ベクター側までシーケンスして、M13Forwardプライミングサイトを
確かめてみようと思います。
ありがとうございました。