次第にPCRの増幅が悪くなっいきます

質問

380bp程度の増幅物が生成されるはずのPCRをやっていますが、同じ条件でやってもバンドが薄くなったり、きれいに出たりと安定しません。最近は回を重ねるごとにバンドがどんどん薄くなっていくような気がします。
ラボの経験豊かな助手さんは、経験上、ずっと部屋にこもって実験をしていると部屋が汚染されていることによるコンタミがあるかもしれないから、空気を入れ替えたり白衣を変えたりした方が良い、といいます。私が以前いたラボよりもサンプルを混和する部屋が狭いのは確かですが、今までそんな提案をされたことはなく、そもそもそれが決定的な原因だとは信じがたいです。

サンプルのDNA（血液からキットで抽出）の劣化の可能性はありますが、それ以外でこのように不安定になる理由は何がかんがられますでしょうか。

プライマーはすでに先輩がデザインして、うまく機能することが分かっていますが、これも劣化している可能性は否定できません。アニーリングは54度、MgClは試行錯誤の結果、2.0mMでやっています。HotStartで、サイクラーの設定は95度10分、95度30秒・54度30秒・72度30秒を35サイクル、72度で7分、4度で保存、としています。

あわせて、皆様がこのようなトラブルや汚染を防ぐために心がけているコツのようなものがありましたら、当たり前のことでも、お教えください。

回答No.1

owata-www

一番あり得るのは酵素が失活しているケースだと思いますが…

あと、プライマーが劣化している可能性はMSで確認するなどしてとりあえず確認してください

お礼

御解答ありがとうございます。
別のサンプルでは増幅しすぎるぐらいに増幅しました。テンプレートの問題だったようです。

あと、実験助手のアドバイスにより、数日PCRをかけずに置くと元のサンプルもかかりやすくなりました。不思議なことですが、何らかの活性のある物質の混入があり、その物質が失活する？のかもしれません。