アニーリングの温度設定について

質問

一般的にアニーリングの温度を上げるとプライマーの特異性が上がると聞きました。
一体、何℃まで上げることが可能なのでしょうか。
現在、64℃でアニーリングをしているのですが、それでも増幅ミス(プライマーとミスマッチのあるDNAの増幅)が起こっているようです。

回答No.1

cooh · ベストアンサー

伸張反応の温度まで上げることができます。
2℃か3℃刻みで上げてみるということを
試してみたらいかがでしょうか。
例えば伸張反応を72℃でやっているのであれば、
アニーリング温度は66℃、68℃、70℃、72℃と
条件を振ってみるというふうに。

回答No.3

noname#17364

わたしもNo.1さんのように条件を振ってやるようにお勧めします。あとはstep-down PCRでやるという手もあるでしょう。

それで改善しなければ、Primerを設計し直した方が良いと思いますよ。

回答No.2

Kohntarkosz

用いているプライマーのTm値の上下5度ぐらいで反応させると増幅させやすいです。
この場合、特異性を上げたいのですから、最大でTm値プラス5度まで上げてみるとよいでしょう。