plasmid DNAがない

質問

先輩から目的遺伝子が組み込まれたplasmidを、
competent cellに感染させ、増やして欲しいと
言われ実験をおこなっています。
しかし、コロニーピックアップし一晩培養した
培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの
抽出をおこなったのですが、全てDNAが10ng程度しかなく、
困っています。

私の考えでは、抗生物質含有の培地のコロニーを
ピックアップし、さらにスケールアップする際も
抗生物質含有の培地で培養したので、プラスミドDNA
が入っていないとは考えられないのですが、、、。

今のところ、キットでタンパク沈殿させた際の
DNAの濃度をはかり、プラスミドの増殖をチェックし
ようと考えています。（キットの操作には間違いは
ありませんでした）

何か、考えられる原因があれば詳しい方お教えください。

ちなみに今までの実験の流れは、以下のように行いました。
１．plasmid　DNA（invitrogen pcDNA3.1)を
one shot competent cellに感染させる
２．アンピシリン含有LB培地によりセレクション
３．コロニーを一晩5mlのアンピシリン含有LB培地で培養しスケールアップ
４．１mlの上清回収し、プラスミドDNA抽出

回答No.4

Dr_Hyper

invitrogen pcDNA3.1は大腸菌へのダメージが大きい場合が多く（理由はわかりません）、ちゃんと大腸菌が増えてもplasmidを落としていることがあります。competnet cellをHB101のようなよく増える株に変えてやるとか、Ampのかわりにカルベニシリン（carbenicillin）を使用すると良い場合が多いです。とりあえずいろんな操作が不安であれば、まずplateに生えたコロニーをPBSなどを少量かけてからスクレパーでカキとってmini-prepします（今のkitで問題ありません）。plate状でコロニーになっていればほとんどの場合plasmidを落とすことがありませんので、とにかくそれで確認後、ちゃんとplasmidがあれば上記の抗生剤や株をかえることを試してください。もしそれでもだめな場合はplateを何枚も用意してplateで増えた分を回収してとれるだけとってkitでとります。スマートではありませんが先輩にせかされるのであれば一番近道です。

補足

夜遅く、朝早く？ご回答有り難うございます。

plasmidの脱落ですか。そういうことも、あるんですね。

plateに生えたコロニー中にプラスミドDNAがあるかを
チェックする方法で、コロニーからmini-prepをする方法を
教えて頂きましたが、このスケールからどのくらいDNAは
取れる物なんでしょうか？
方法としては、コロニーピックアプし、
一部を滅菌水などに落とし遠心により集菌し、
キットのプロトコルどおり行えばいいのでしょうか？

本を読んだら、コロニーからPCRする方法で
確かめる方法もあるようですが、、、。

すいません、質問だらけで。

回答No.3

MIYD

大腸菌の中のプラスミドが少ないのか、
カラムの問題かわからないので、

5ml中1ml分しかカラムにかけないのでしたら、
先に1mlをアルカリSDS法で取ってみてはいかがでしょうか。

インサートが大きいプラスミドでしたら、
そのくらいの収量しかないのかもしれません。
前に増やした人に確認して、
場合によっては1~2Lくらい振ることになるかもしれません。

お礼

夜遅くご回答ありがとうございます。
確認してみます。

回答No.2

-ROM

だから「上清」だから駄目なのではないですか (上清の意義は理解されていますか)。

補足

訂正します。

培養上清→大腸菌の培養液

１mlの上清→１mlの大腸菌培養液

回答No.1

ebikichi

＞培養上清を回収し、QIAGENのキットでプラスミドDNAの抽出を

プラスミドが取れないのは当然です。
培養上清にはプラスミドは含まれていません。
プラスミドは、細胞の中にあるのです。

補足

済みません、書き方がまずかったです。
培養した上清を遠心して、培地除去後
ペレットからプラスミドDNAの抽出を
おこなっています。